內嗎啡肽在大鼠視網膜上的表達

張樂石 李志方 劉力學 薛偉寧 樊雙義

基礎研究論著

內嗎啡肽在大鼠視網膜上的表達

張樂石 李志方 劉力學 薛偉寧 樊雙義

目的 探討內嗎啡肽在視網膜的分布，內嗎啡肽和μ阿片受體在視網膜的共存關系。方法 成年雄性SD大鼠12只，分為2組，一組為正常對照組（n＝6），另一組建立高眼壓模型（高眼壓模型組，n＝6）。運用免疫組織化學方法觀察內嗎啡肽1（EM-1）、內嗎啡肽2（EM-2）和μ阿片受體在視網膜中的分布和共存，并利用高眼壓模型觀察高眼壓對EM-2在視網膜表達的影響。結果視網膜無EM-1分布；EM-2主要分布于視網膜節細胞層；EM-2與NeuN、μ阿片受體在視網膜節細胞層共存；高眼壓模型大鼠視網膜節細胞層內單位面積表達EM-2的細胞數明顯少于正常大鼠（0.8± 0.1個／mm3vs.4.6±0.8個／mm3），差異有統計學意義（t＝3.88，P＜0.05）。結論 EM-2分布在視網膜節細胞層，與μ阿片受體共存，在高眼壓狀態下，EM-2的表達減少。

內嗎啡肽；視網膜；高眼壓；分布

內嗎啡肽是內源性阿片肽家族的一個成員，是1997年Zadina等［1］在牛腦中發現，對μ阿片受體具有高選擇性的、強效的內源性配體。內嗎啡肽是一個四肽，氨基酸殘基序列為Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 或Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2，分別命名為內嗎啡肽1 （EM-1）和內嗎啡肽2（EM-2）［2］。內嗎啡肽在鎮痛、心血管功能調節、呼吸功能調節以及消化功能調節都具有一定的作用，近期有文獻報道在腸神經系統中發現內嗎啡肽能神經元的分布，但內嗎啡肽在視網膜的分布尚未見報道。脊椎動物的視網膜是一個復雜的、具有重要感知功能的組織，鈣結合蛋白D-28k、鈣視網膜蛋白、一氧化氮合酶等表達于哺乳動物視網膜，近期有文獻報道內源性阿片肽家族的另一成員——腦啡肽在視網膜有表達，并與感光關系密切［3］。本文擬研究內嗎啡肽在視網膜的分布，現將結果報告如下。

材料與方法

一、材料

成年雄性SD大鼠12只，購自第四軍醫大學實驗動物中心，分為2組，每組6只大鼠，一組為正常對照組，另一組建立高眼壓模型。藥品與試劑：兔抗EM-1多克隆抗體（1∶200 Abcam）；兔抗EM-2多克隆抗體（1∶200 Abcam）；小鼠抗NeuN多克隆抗體（1∶500 millipore）；生物素標記的驢抗兔多克隆抗體（1∶500 chemion）；Alexa594標記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶500 Invitrogen）；FITC標記的生物素（1∶1 000 Vector）。

二、方法

1.麻醉及高眼壓模型建立

大鼠經7%水合氯醛（0.4 ml／kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定在手術臺上，利多卡因滴眼。以一次性輸液器連接4.5號針頭經角膜緣刺入前房，接500 ml生理鹽水，距大鼠垂直距離為1.5 m，保持60 min。右眼以針頭刺穿行假手術。7 d后處死取材。

2.取 材

25%烏拉坦（1ml／kg）腹腔注射麻醉，開胸經左心室穿刺入升主動脈，先灌入200 ml 0.01 mol／L PBS沖凈血液，再用含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（PB）500 ml灌注固定，取雙側眼球，放入上述溶液后固定24 h。

3.染 色

用恒冷箱切片機對眼球進行冠狀位冰凍切片，片厚12 μm，隔2張取1張，切片立即貼于經載膠處理的載玻片上。第1組第1套切片用于EM-1／EM-2單標記的免疫組織化學染色，步驟如下：①兔抗EM-1多克隆抗體（1∶200 Abcam）／兔抗EM-2多克隆抗體（1∶200 Abcam）4℃孵育72h；②加入Biotin標記的驢抗兔多克隆抗體（1∶200，Millipore），室溫孵育4 h；③加入ABC復合物（1∶200，Vector），室溫孵育2 h，DAB呈色10 min。將經過上述處理的切片室溫干燥后用中性樹膠封片，使用明視野顯微鏡觀察。

第1組第2套、第2組第1套切片用于EM-2／MOR雙標的免疫熒光組織化學染色，步驟如下：①兔抗EM-2多克隆抗體＋小鼠抗MOR（1∶200，Abcam）4℃孵育72 h；②生物素標記的驢抗兔多克隆抗體（1∶500 chemion）＋Alexa594標記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶500 Invitrogen），室溫孵育4 h；③FITC標記的生物素（1∶1 000 Vector），室溫孵育2 h。

第1組第3套、第2組第2套切片用于EM-2／NeuN雙標的免疫熒光組織化學染色，步驟如下：①兔抗EM-2多克隆抗體＋小鼠抗NeuN多克隆抗體（1∶500，Millipore）4℃孵育72 h；②生物素標記的驢抗兔多克隆抗體（1∶500 chemion）＋Alexa594標記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶500 Invitrogen），室溫孵育4 h；③FITC標記的生物素（1∶1 000 Vector），室溫孵育2 h。

上述各步驟之間均用0.01 mol／L的PBS （pH7.3）洗片3次，每次10 min。所有上述一抗和二抗均用含5%驢血清、0.3%Triton X2100、0.25%角叉菜膠和0.05%疊氮化鈉的0.01 mol／L PBS（pH7.3）稀釋。將經過上述處理的切片經室溫干燥，以2.5%三乙烯二胺和等量甘油的混合液封片，激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1000，Olympus）觀察。同時以正常羊血清代替一抗孵育第2套切片，其余染色步驟與上相同進行陰性對照實驗，結果均為陰性。

4.細胞計數

每個標本取5個獨立視野（×600），計算每個獨立視野內的陽性細胞數，取平均值作為該標本單位面積內的陽性細胞數。

三、統計學處理

采用SPSS 12.0統計學軟件對數據進行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、內嗎啡肽在正常大鼠視網膜上的分布

免疫組織化學染色顯示，未見EM-1陽性產物在視網膜上的分布（圖1A，×20），EM-2陽性產物分布在視網膜節細胞層（GCL）神經細胞胞體［圖1 B（×20）、C（×100）］，且EM-2與NeuN（圖2）、μ阿片受體（圖3）在視網膜上的共存。

二、內嗎啡肽在高眼壓模型大鼠視網膜上的分布

對大鼠眼前房行高眼壓處理后，視網膜節細胞層水腫且結構松散，行NeuN染色見神經細胞數量無明顯減少，而在EM-2在視網膜節細胞層的表達減少（圖4）。正常大鼠視網膜節細胞層單位面積EM-2陽性細胞數平均為4.6±0.8個／mm3，高眼壓模型大鼠視網膜節細胞層單位面積EM-2陽性細胞數平均為0.8±0.1個／mm3（表1）。高眼壓模型大鼠視網膜節細胞層內單位面積表達EM-2的細胞數明顯少于正常大鼠，差異有統計學意義（t＝3.88，P＜0.05）。

圖1 EM-1、EM-2陽性產物在小鼠視網膜上的分布

圖2 EM-2免疫陽性產物與NeuN在小鼠視網膜節細胞層的共存

表1 高眼壓組和正常對照組視網膜節細胞層EM-2陽性細胞數（±s，n＝6）

表1 高眼壓組和正常對照組視網膜節細胞層EM-2陽性細胞數（±s，n＝6）

組 別大鼠1大鼠2大鼠3大鼠4大鼠5大鼠6高眼壓組0.6±0.10.2±0.11.3±0.20.7±0.10.8±0.21.2±0.1正常對照組7.2±1.23.9±0.85.4±0.55.0±1.52.2±0.33.9±0.6

圖3 EM-2免疫陽性產物與μ阿片受體在小鼠視網膜節細胞層的共存

圖4 高眼壓處理后7 d的小鼠視網膜節細胞層

討 論

內嗎啡肽主要分布在中樞神經系統，與μ阿片受體分布相似，但EM-1和EM-2的分布并不相同。EM-1在腦部的分布比EM-2密集而廣泛，主要分布于孤束核、臂旁核、隔區、斜角帶、終紋床核、韁核、丘腦腹后內側核、下丘腦后核、導水管周圍灰質（PAG）、藍斑、伏核、杏仁核及運動性語言中樞等部位；EM-2在脊髓的分布比EM-1更為廣泛，主要分布于脊髓背角的小直徑初級傳入神經、脊髓背角淺神經層、背根及三叉神經脊束核。它也出現于腦中富有阿片受體的區域：伏核、丘腦中央中核、隔區、下丘腦和杏仁核、藍斑和PAG，但在大腦皮質、紋狀體、海馬、孤束核和背根神經節上分布很少［4］。EM-2樣免疫反應纖維和膨體在脊髓膠狀質和邊緣系統的分布與腦啡肽、強啡肽相似，與P物質則共存于三叉神經脊束核，從而提示它在痛覺調節中起重要作用［5］。EM-1及EM-2于在體實驗中均表現出較強的鎮痛作用［6］。

研究結果顯示，在視網膜上只有EM-2表達，無EM-1表達，EM-2陽性神經元分布在節細胞層，且與神經元特異性標記NeuN及μ阿片受體共存。視網膜內的細胞根據其形態、功能不同，分為無長突細胞、水平細胞、雙極細胞、節細胞、感光細胞等。根據視網膜內EM-2陽性神經元的形態可判定其屬于節細胞。

在高眼壓模型大鼠視網膜上，EM-2陽性細胞的表達明顯減少，提示EM-2在青光眼的發生發展中起到一定的作用。

致視網膜損傷的病理基礎是視網膜節細胞的進行性死亡。臨床研究結果證實，盡管許多青光眼患者的眼壓已得到控制，但視野和視神經損害仍繼續發展，有時將導致視力完全喪失［7］。既往研究顯示，內源性阿片肽對神經細胞、心肌缺血具有保護作用，當心肌缺血時，心臟通過自身分泌或者旁分泌內源性阿片肽，并作用于心肌上的阿片受體，發揮重要的心肌保護作用［8-9］。阿片受體激動劑通過改善神經細胞供血、減輕細胞水腫、降低TNF-α表達、減輕炎癥反應等途徑起到缺血保護作用［10-11］。內源性阿片肽可激活磷酸肌醇3-激酶通路、減少氧自由基形成、抑制神經細胞凋亡［12］。而在高眼壓模型上視網膜節細胞層的EM-2表達減少，提示內源性阿片肽在視網膜上可能起到缺血保護的作用，EM-2的表達減少是高眼壓造成視網膜持續性損害的可能機制。進行外源性阿片肽預處理可能能夠減輕高眼壓對視網膜的持續損害，但需要進一步研究證明。

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Expression of endomorphins in the retina of rat

Zhang Leshi，Li Zhifang，Liu Lixue，Xue Weining，Fan Shuangyi.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China Corresponding author，Zhang Leshi，E-mail：zlsfmmu＠163.com

Objective To investigate the distribution of endomorphins（EM）in the retina，and assess the coexistence of EM and μ-opioid receptor in the retina.Methods Twelve Sprague Dawley（SD）rats were divided into the control（n＝6）and intraocular hypertension model groups（n＝6）.Immunohistochemistry was used to detect the expression and coexistence of EM-1，EM-2 and μ-opioid receptor in the rat retina，and evaluate the influence of intraocular hypertension upon the expression of EM-2.Results EM-1 was not expressed in the retina.EM-2 was mainly distributed in the retinal ganglion cell layer.EM-2，NeuN and μopioid receptor coexisted in the retinal ganglion cell layer.The density of cells expressing EM-2 in the intraocular hypertension model group was（0.8±0.1）／mm3，significantly lower compared with（4.6±0.8）／mm3in the control group（t＝3.88，P＜0.05）.Conclusions EM-2 was expressed in the retinal ganglion cell layer and coexisted with μ-opioid receptor.The expression of EM-2 was decreased under intraocular hypertension.

Endomorphins；Retina；Intraocular hypertension；Distribution

2014-12-11）

（本文編輯：楊江瑜）

10.3969／g.issn.0253-9802.2015.04.005

100071北京，軍事醫學科學院附屬醫院神經內科

，張樂石，E-mail：zlsfmmu＠163.com