抗壞血酸/半胱氨酸體系美拉德反應形成風味物質動力學

唐樂攀，楊小洪，余愛農,*

抗壞血酸/半胱氨酸體系美拉德反應形成風味物質動力學

唐樂攀1,2，楊小洪2，余愛農1,2,*

（1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院化學與環境工程學院，湖北 恩施 445000）

在抗壞血酸/半胱氨酸體系中，應用溶劑萃取法對美拉德反應形成的特征風味物質進行富集，通過氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）進行定性研究和準確的定量分析，研究其反應動力學。結果表明：基于抗壞血酸的美拉德反應與傳統的美拉德反應存在明顯差異，主要表現在起始反應溫度和風味物質的種類及動力學上。對特征風味物質進行動力學分析發現，2-乙?；绶院?-乙?；绶杂捎诮Y構相似，含量及動力學表現也極為相似；2-丙基四氫噻吩在高溫下濃度會先升高后降低，最終均穩定在0.035 mmol/L左右；2-甲基-4-丙基噻唑和2-乙?；邕蚝坎顒e很大，表明兩者生成機理完全不同；2-甲基四氫噻吩-3-酮和四氫噻吩-3-酮結構相似，但后者會進一步反應使得兩者含量差別較大；甲基吡嗪的生成滿足零級動力學，且反應溫度高于125 ℃時其生成速率基本保持不變。

美拉德反應；風味物質；動力學

美拉德（Maillard）反應是食品加工和貯藏過程中發生的最主要的非酶褐變反應之一，其實質是羰基化合物和氨基化合物在一定溫度下發生的一系列復雜反應的總稱[1]。由于該反應可造成食品營養價值的改變，使食品顏色加深，產生特殊的揮發性產物，賦予或改變食品的風味[2]，因此在食品工業中有著特殊的地位。特別是隨著人們更加深入地研究，發現使用美拉德反應制備的香料具有香味更加自然濃厚的特點，因此美拉德反應形成風味物質的研究受到廣泛重視。

目前對于美拉德反應形成風味物質的研究多集中于產物種類的分析、反應條件的影響和生成機理的研究上[3-7]。但是由于美拉德反應的復雜性，使得反應程度往往難以把握，一般的定性研究并不能對香味物質進行控制和預測，而以定量為基礎的動力學研究并不多見。其次，美拉德反應研究體系多以還原糖為主，而抗壞血酸作為一個在美拉德反應中引起廣泛注意且具有潛在羰基組分的化合物[8]，廣泛存在于植物性食物及動物食品中，但是對其研究卻并不多見。就抗壞血酸和半胱氨酸體系而言，Adams等[9]研究了在干燥、烘烤、無溶劑、K2CO3存在等條件下抗壞血酸與半胱氨酸反應形成呋喃類化合物和噻吩類化合物，其他研究工作主要由本課題組完成的，包括pH值、金屬離子、尿素以及肌肽等對揮發性物質種類的影響及其形成機理[10-13]，而有關抗壞血酸/半胱氨酸體系美拉德反應動力學研究均未見文獻報道。

對美拉德反應進行反應動力學研究，可預測反應速率控制點以及對反應的進程進行最優設計和最優控制。本實驗以抗壞血酸和半胱氨酸美拉德體系為基礎，使用溶劑萃取法對產生的風味物質進行富集、濃縮，應用氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）以及氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、標準物質和線性保留指數（linear retention index，LRI）對不同溫度條件下風味物質進行定量以及定性分析。選取分離度、峰型較好，LRI之間誤差較小，GC-MS相似度較高的特征風味成分作為研究對象。通過GC-FID進行準確定量并找到其含量隨溫度、時間變化關系，分析其動力學，為今后對于基于抗壞血酸的風味物質生成的控制和預測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-抗壞血酸、L-半胱氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無水硫酸鈉（均為分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司；乙醚（分析純） 上海嘉定馬陸化工廠有限公司；正十三烷、C5～C22正構烷烴美國Sigma-Aldrich公司；四氫噻吩-3-酮、3-乙?；绶浴?-乙酰基噻吩 比利時Acros Organics公司；2-甲基-四氫噻吩-3-酮、3-甲基-2-乙?；绶浴⑧绶裕?-2-b）并噻吩 東京Chemical Industry公司；2-乙?；邕?、2-甲基吡嗪 中國百靈威化學技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-MS 6890N氣相色譜-5975I質譜聯用儀、1260高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、6890N氣相色譜儀（配有FID檢測器） 美國安捷倫科技公司；干浴式氮吹儀 上海安普科學儀器有限公司；BS-124S電子天平 德國賽多利斯公司；P160001厚壁耐壓瓶 北京欣維爾玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫HP-5毛細管色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25μm）；進樣量2μL；進樣口溫度270 ℃；不分流進樣；載氣流量0.9 mL/min；程序升溫：柱溫初始40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min上升至260 ℃，然后以15 ℃/min上升至280 ℃，保持1 min。GC-FID和GC-MS采用同樣的色譜條件。

1.3.2 質譜條件

電子轟擊離子源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離電壓70 eV；電子倍增電壓1 753 V；掃描速率1 scan/s；質量掃描范圍30～400 amu。

1.3.3 內標的配制

用微量移液器準確吸取60 μL正十三烷（0.06 mL，45.6 mg，質量濃度為0.76 g/mL）并溶解于20 mL無水乙醚中。此內標相當于2.28 mg/mL的正十三烷乙醚溶液[14]?，F配現用。

1.3.4 反應液的制備

[10]，用電子天平準確稱取0.880 7 g（0.005 mol）L-抗壞血酸和0.605 8 g（0.005 mol）L-半胱氨酸溶解于50 mL 0.2 mol/L pH 8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，再用適量NaOH調pH值至8并裝入P160004厚壁耐壓反應瓶中密封。在125、135、140、145、155 ℃條件下分別反應60、90、120、150、180、210 min，反應完成后取出快速冷卻。每份樣品均反應3 份作為平行樣。

1.3.5 風味物質的萃取及濃縮

向50 mL反應液中加入100 μL上述內標溶液（相當于0.228 mg正十三烷），分別用20、20、15、15 mL無水乙醚萃取4 次[15-16]，合并萃取液，并加入適量無水硫酸鈉干燥2 h。待干燥完成，倒出萃取液，使用氮吹儀濃縮至約2 mL，轉移至氣相色譜進樣瓶準備進樣。

2 結果與分析

2.1 反應溫度對產物生成的影響

使用GC-FID對不同溫度下反應不同時間形成的揮發物進行分析，圖1和圖2分別是125 ℃反應60 min和140 ℃反應60 min樣品的色譜圖。由圖1可知，在125 ℃條件下，反應60 min后樣品中除了內標物質外，基本上沒有檢測出其他物質，表明此溫度下美拉德反應十分緩慢，幾乎沒有風味物質產生。這與經典的美拉德反應有著較大的差異，傳統的還原糖和氨基酸之間的美拉德反應最高溫度一般只有110 ℃，最低在80 ℃下就能夠反應[17]，說明基于抗壞血酸的美拉德反應有著特殊的性質，值得進一步深入研究。當反應溫度上升至140 ℃后，反應風味物質含量及種類都有明顯的增加[10]，大致上，一般食品加工溫度在160 ℃以內，否則會損失營養物質，因此本實驗選擇以140 ℃為中心，研究125～155 ℃條件下溫度對風味物質動力學特征的影響。

圖1 125 ℃反應60 min風味物質氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of volatile flavor compounds formed by Maillard reaction at 125 ℃ for 60 min

圖2 140 ℃反應60 min風味物質氣相色譜圖Fig.2 GC chromatogram of volatile flavor compounds formed by Maillard reaction at 140 ℃ for 60 min

2.2 樣品中風味物質的定性分析

表1 風味物質線性保留指數的鑒定Table 1 Identification of volatile favor compounds by LRI

根據實驗溫度范圍，選取具有代表性的125、140、155 ℃，反應時間為120 min的3 組樣品，在上述GC-MS條件下進行分析，并通過質譜數據庫對各個峰進行初步定性。其次，分別在GC和GC-MS中測定C5～C22正構烷烴，計算各樣品中所有物質的LRI取平均值。之后，挑選標準物質分批進行GC分析，并根據C5～C22正構烷烴保留時間計算標準物質的LRI。最后查找相關文獻，確定化合物的LRI[12]。表1為相應10 種化合物的LRI。

通過比較色譜圖，選取分離度、峰型較好，LRI之間誤差較小，GC-MS相似度較高的化合物作為本實驗的研究對象。

2.3 風味物質形成的動力學

通過2.2節對化合物的定性分析，根據GC色譜圖中各物質與內標物的峰面積比，換算出各化合物的濃度隨時間的變化關系。

2.3.1 噻吩類

圖3 不同溫度條件下2-乙?；绶詽舛入S時間的變化Fig. 3 2-Acetylthiophene production at a function of reaction time at different temperatures

圖4 不同溫度條件下3-乙酰基噻吩濃度隨時間的變化Fig.4 3-Acetylthiophene production as a function of reaction time atdifferent temperatures

圖3、4分別是不同溫度條件下2-乙?；绶院?-乙酰基噻吩濃度隨時間變化關系。兩種物質結構相似，只是取代基的位置不同，故其含量及動力學表現也極為相似。兩種物質的含量均隨著溫度的升高及加熱時間的延長而增加，并在155 ℃條件下穩定在0.15 mmol/L左右。當反應溫度由145 ℃升高到155 ℃時，60 min時兩種物質含量均變化明顯，增加了近3 倍。2-乙酰基噻吩由0.034 1 mmol/L升高至0.099 9 mmol/L，3-乙?；绶杂?.021 5 mmol/L升高至0.067 4 mmol/L。

考察兩種物質濃度隨時間的變化關系，發現其變化滿足零級動力學方程。分別對其擬合得到相應的表觀速率常數（k），見表2。

在低溫125 ℃條件下，兩種物質的表觀速率常數基本相同，這是由于低溫條件下兩種物質生成都較慢，故差別不大。但是隨著溫度的升高，2-乙?；绶缘谋碛^速率常數增加更快，表明高溫更有利于 其生成。

圖5為2-丙基四氫噻吩濃度隨時間的變化關系，其與上述兩種化合物差異較大。當溫度達到140 ℃以上時，2-丙基四氫噻吩濃度會先增加至約0.055 mmol/L，之后隨著反應時間的增加，濃度會逐漸減小，最終穩定在0.035 mmol/L左右。可能原因是較高溫度條件下，2-丙基四氫噻吩會繼續發生其他反應而被消耗。

圖5 不同溫度條件下2-丙基四氫噻吩濃度隨時間變化Fig.5 2-Propyltetrahydrothiophene production as a function ofreaction time at different temperatures

2.3.2 噻吩酮類

圖6 2-甲基四氫噻吩-3-酮濃度隨時間變化Fig.6 2-Methyltetrahydrothiophen-3-one production as a function of reaction time at different temperatures

圖7 四氫噻吩-3-酮濃度隨時間變化Fig.7 Tetrahydrothiophen-3-one production as a function of reaction time at different temperatures

圖8 四氫噻吩-3-酮進一步反應機理[133,,1188]]Fig.8 Proposed formation mechanism of tetrahydrothiophen-3-one[13,18]

2-甲基四氫噻吩-3-酮和四氫噻吩-3-酮的濃度隨時間變化的關系分別見圖6和圖7。雖然兩種物質結構類似，但是濃度變化趨勢都完全不同，表明其生成機理也完全不同。據文獻[13,18]報道，抗壞血酸會按照圖8所示的途徑發生自身熱解反應，之后進一步反應生成噻吩酮類。由圖8可知，抗壞血酸分解后生成的四氫噻吩-3-酮會進一步與巰基加成，生成新的化合物，導致其含量比2-甲基四氫噻吩-3-酮低。

圖9 2-甲基-4-丙基噻唑濃度隨時間的變化Fig.9 2-Methyl-4-propylthiazole production as a function of reaction time at different temperatures

圖10 2-乙?；邕驖舛入S時間的變化Fig.10 2-Acetylthiazole production as a function of reaction time at different temperatures

2.3.3 噻唑類

由圖9、10可知，兩種噻唑濃度差別很大，2-甲基-4-丙基噻唑濃度最高只有0.02 mmol/L，且溫度繼續升高，其含量基本保持不變。相同溫度條件下，2-乙?；邕虻臐舛雀?，且其濃度隨時間變化較明顯。當溫度從145 ℃升高到155 ℃時，反應60 min后其濃度由0.043 mmol/L升高到了0.073 mmol/L，但之后濃度開始下降，最后穩定在0.06 mmol/L。

2.3.4 吡嗪類

圖11 甲基吡嗪濃度隨時間的變化Fig.11 Methylpyrazine production as a function of reaction time at different temperatures

由圖11可知，反應溫度高于125 ℃時，甲基吡嗪的生成濃度顯著高于125 ℃時的生成濃度，即使在125 ℃條件下，反應210 min也只有少量甲基吡嗪生成，說明在本實驗體系中，只有在135 ℃以上時才能形成具有燒烤風味的甲基吡嗪。

根據實驗數據，分別與零、一、二級動力學模型進行擬合，結果發現甲基吡嗪的生成滿足零級動力學，與文獻[19]報道相一致，并計算得到相應的表觀速率常數，見表3。

表3 不同溫度下甲基吡嗪的表觀速率常數Table 3 Apparent rate constants of methylpyrazine at different temperatures

由表3可知，除了最低溫度125 ℃之外，其他所有溫度條件下甲基吡嗪的表觀速率常數基本相同，表明當溫度升高到一定程度時，其生成速率與溫度的關系不再明顯，與文獻[19]報道結果相一致。其原因可能是受反應機理的影響，據相關文獻報道[20]，吡嗪類化合物的生成與氨基酸的降解有關，當溫度高于125 ℃時，半胱氨酸很快會分解完全，導致吡嗪類化合物前體物迅速積累，故繼續升溫并不會繼續影響其反應速率。

3 結 論

本實驗使用溶劑萃取法，通過GC-MS和GC-FID對噻吩、噻唑、吡嗪等特征風味物質進行了定性定量分析。結果發現在低溫條件下（125 ℃）基本上沒有檢測出除了內標物質外的其他物質，說明抗壞血酸/半胱氨酸體系在125 ℃以下美拉德反應緩慢，與傳統美拉德反應存在較大差異。

對特征風味物質進行動力學分析發現，不同溫度條件下2-乙酰基噻吩和3-乙?；绶詽舛入S時間變化趨勢相近，可能原因是兩者結構相似，因此生成機理相同。低溫條件下兩種物質的表觀速率常數基本相同，但是隨著溫度的升高，2-乙酰基噻吩的生成速率增加更快；較高溫度條件下，2-丙基四氫噻吩濃度隨著反應時間的延長而增加，但之后逐漸減小，最終穩定在0.035 mmol/L左右；2-甲基四氫噻吩-3-酮和四氫噻吩-3-酮兩種物質雖然結構類似，但是含量卻差別較大，表明其生成機理完全不同，且四氫噻吩-3-酮會繼續參與反應生成新的化合物；兩種噻唑類物質2-甲基-4-丙基噻唑和2-乙?；邕驖舛入S時間變化趨勢也不盡相同，表明兩種物質的生成機理不同；通過研究甲基吡嗪濃度變化發現，當溫度升高到一定程度時，其生成速率保持不變，與文獻[19]的報道相一致。

參考文獻：

[1] HODGE J E. Dehydrated foods, chemistry of browning reactions in model systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1953, 1(15): 928-943.

[2] SILVAN J M, van de LAGEMAAT J, OLANO A, et al. Analysis and biological properties of amino acid derivates formed by Maillard reaction in foods[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 41(5): 1543-1551.

[3] UMANO K, HAGI Y, NAKAHARA K, et al. Volatile chemicals formed in the headspace of a heated D-glucose/L-cysteine Maillard model system[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1995, 43(8): 2212-2218.

[4] CERNY C. Origin of carbons in sulfur-containing aroma compounds from the Maillard reaction of xylose, cysteine and thiamine[J]. LWTFood Science and Technology, 2007, 40(8): 1309-1315.

[5] CERNY C, BRIFFOD M. Effect of pH on the Maillard reaction of [13C5] xylose, cysteine, and thiamin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(4): 1552-1556.

[6] AMES J M, GUY R C, KIPPING G J. Effect of pH and temperature on the formation of volatile compounds in cysteine/reducing sugar/starch mixtures during extrusion cooking[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(4): 1885-1894.

[7] MOTTRAM D S, NOBREGA I C C. Formation of sulfur aroma compounds in reaction mixtures containing cysteine and three different forms of ribose[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(14): 4080-4086.

[8] ROGACHEVA S M, KUNCHEVA M J, PANCHEV I, et al. L-ascorbicacid in nonenzymatic reactions. I. Reaction with glycine[J]. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung A, 1995, 200(1): 52-58.

[9] ADAMS A, de KIMPE N. Formation of pyrazines from ascorbic acid and amino acids under dry-roasting conditions[J]. Food Chemistry, 2009, 115(4): 1417-1423.

[10] YU Ainong, ZHANG Aidong. Aroma compounds generated from thermal reaction of L-ascorbic acid with L-cysteine[J]. Food Chemistry, 2010, 121(4): 1060-1065.

[11] YU Ainong, TAN Zhiwei, SHI Boan. Influence of the pH on the formation of pyrazine compounds by the Maillard reaction of L-ascorbic acid with acidic, basic and neutral amino acids[J]. Asia-Pacifi c Journal of Chemical Engineering, 2012, 7(3): 455-462.

[12] 劉應煊. 抗壞血酸與半胱氨酸的Maillard反應形成香味化合物的研究[D]. 武漢: 中國地質大學, 2010: 17-23.

[13] YU Ainong, TAN Zhiwei, WANG Fasong. Mechanism of formation of sulphur aroma compounds from L-ascorbic acid and L-cysteine during the Maillard reaction[J]. Food Chemistry, 2012, 132(3): 1316-1323.

[14] BAISIER W M, LABUZA P L. Maillard browning kinetics in a liquid model system[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1992, 40(5): 707-713.

[15] CHEN J H, HO C T. Comparison of volatile generation in serine/ threonine/glutamine-ribose/glucose/fructose model systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1999, 47(2): 643-647.

[16] CHEN Yong, XING Jinsong, CHIN C K, et al. Effect of urea on volatile generation from Maillard reaction of cysteine and ribose[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(8): 3512-3516.

[17] ZHANG Zhouyao, PAWLISZYN J. Headspace solid-phase microextraction[J]. Analytical Chemistry, 1993, 65(14): 1843-1852.

[18] YU Ainong, TAN Zhiwei, WANG Fasong. Mechanistic studies on the formation of pyrazines by Maillard reaction between L-ascorbic acid and L-glutamic acid[J]. LWT-Food Science and Technology, 2013, 50(1): 64-71.

[19] JOUSSE F, JONGEN T, AGTEROF W, et al. Simplified kinetic scheme of flavor formation by the Maillard reaction[J]. Journal of Food Science, 2002, 67(7): 2534-2542.

[20] YU Ainong, ZHANG Aidong. The effect of pH on the formation of aroma compounds produced by heating a model system containing L-ascorbic acid with L-threonine/L-serine[J]. Food Chemistry, 2010, 119(1): 214-219.

Kinetic Study of Volatile Favor Compound Formation in Ascorbic Acid-Cysteine Maillard Reaction System

TANG Lepan1,2, YANG Xiaohong2, YU Ainong1,2,*
(1. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Enshi 445000, China; 2. School of Chemistry and Environmental Engineering, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China)

This study is based on the ascorbic acid-cysteine Maillard reaction system. The volatile favor compounds were enriched by solvent extraction and analyzed qualitatively and quantitatively by GC-MS and GC-FID. The kinetics of their formation was studied. The results indicated that Maillard reaction based on ascorbic acid was quite different from the conventional one. The kinetic changes of 2-acetylthiophene and 3-acetylthiophene were resembled because of their similar structures. At higher temperature, the concentration of 2-propyltetrahydr othiophene increased at fi rst and then decreased to 0.035 mmol/L. The widely varying concentrations of 2-methyl-4-propylthiazole and 2-acetylthiazole were due to different generation mechanisms. Although the molecular structures of 2-methyltetrahydrothiophen-3-one and tetrahydrothiophen-3-one were similar, the latter one could conduct further reaction, thereby leading to a decrease in its concentration. The generation of methylpyrazine was a zero-order reaction and the rate remained the same at a temperature above 125 ℃.

Maillard reaction; volatiles; kinetics

TS201.2

A

10.7506/spkx1002-6630-201511006

2014-08-11

國家自然科學基金地區科學基金項目（31360408）

唐樂攀（1989—），男，碩士，研究方向為食品化學。E-mail：809328707@qq.com

*通信作者：余愛農（1963—），男，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：anyufoodchem@hotmail.com