乳桿菌屬天然質粒研究進展

孫大慶，李洪飛，宋大巍，楊 健,3，張東杰,3，許曉曦*

乳桿菌屬天然質粒研究進展

孫大慶1,2，李洪飛1，宋大巍1，楊 健1,3，張東杰1,3，許曉曦2,*

（1.黑龍江八一農墾大學 國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；3.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

天然質粒在乳桿菌屬多個菌種中已被發現，它們攜帶了許多重要生理功能和脅迫因子抗性基因，對乳桿菌遺傳、代謝、進化等生物學研究具有重要意義。本文概述乳桿菌屬天然質粒的生物學特征、分布和主要功能，重點對乳桿菌屬天然質粒的復制類型與調控機制的研究進展進行綜述，最后對乳桿菌質粒的未來研究方向進行探討，希望可以為相關研究人員提供有益的參考與借鑒。

乳桿菌屬；質粒；復制；調控；反義RNA

乳桿菌是乳酸菌中一個非常重要的屬，它們廣泛地分布于植物根部和體表、青貯飼料、動物口腔、陰道和胃腸道、發酵食品（乳制品、肉制品、面團、酒、飲料、蔬菜）等多 種自然環境，與人類飲食和健康息息相關[1-4]，是現代食品、醫藥、農業等行業中具有重要經濟價值的益生菌。現已證明，乳桿菌屬多數菌種富含天然質粒，它們在大小、結構、構象、拷貝數和復制調控等方面具有豐富的多樣性[5-7]。這些質粒在滿足自身復制、遺傳和進化需求的同時，也賦予了乳桿菌廣泛的生理特性和更強的環境適應能力，從而使乳桿菌和內生質粒在復雜多變的生存環境和選擇壓力下更好地共生、遺傳和進化[6]。

乳桿菌質粒發現和研究起步較早[8]，但長期以來，人們對乳桿菌質粒的研究始終關注不足。與芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬以及乳酸菌中腸球菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬質粒研究比較，人們對乳桿菌屬質粒復制、遺傳、進化、功能等多方面了解仍相當有限，這在乳桿菌質粒以往的綜述性文獻中可見一斑[5-7]。然而，這種情況在近些年已經發生了轉變。我們統計發現，目前美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的RefSeq數據庫中乳桿菌質粒基因組數據正快速增加，至今已收錄23個種、165個乳桿菌質粒完整基因組序列，已超過腸球菌屬（109個）、乳球菌屬（87個）和鏈球菌屬（49個），成為乳酸菌中測序質粒數量最多的屬；2000年以后有關乳桿菌質粒的研究報道數量超過以前所有報道，占總數57.9%（317/547）。這些數據表明，乳桿菌質粒研究在近些年取得了快速的發展，使我們對乳桿菌質粒生物學特征有了更多、更深刻的了解。為此，我們在本文中對乳桿菌天然質粒基本特征、分布、復 制和功能進行比較全面的綜述，希望可為乳桿菌質粒相關的研究者提供一些有益的信息。

1 乳桿菌質粒基本特征

一般而言，乳桿菌質粒大小一般在1～100 kb之間，少數巨型質粒可達100 kb以上[6]。2007年，Li Yongtao等[9]研究發現，被檢的33株唾液乳桿菌普遍含有巨型質粒，其他47種、91株乳桿菌中發現6種、7株存在巨型質粒，這些巨型質粒大小在120～490 kb之間。這表明乳桿菌屬中唾液乳桿菌可能普遍含有巨型質粒，其他乳桿菌種雖然也有巨型質粒，但并不常見。乳桿菌質粒DNA分子通常是雙鏈、閉合、環狀，但偶爾也有雙鏈、線性質粒發現于乳桿菌的報道，如植物乳桿菌pC30il[10]、羅伊乳桿菌pGT232[11]、德氏乳桿菌pLBB1[12]、干酪乳桿菌pW56[13]和唾液乳桿菌pLS51A、pLS51B、pLS51C、pLS 51D[14]。乳桿菌質粒G+C含量相對穩定，通常在30%～45%之間，接近于乳桿菌染色體基因組G+C含量[15]。

2 乳桿菌質粒的分布

自1976年Chassy等[8]在干酪乳桿菌中第一次發現質粒以來，至今從不同環境分離的乳桿菌中含有天然質粒的報道已有很多。從這些報道中可以清晰地知道，乳桿菌屬是一個多樣性豐富的天然質粒庫，許多乳桿菌菌種含有一個或更多天然質粒，目前發現，含有質粒較多的菌種有短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌，含有質粒最多的菌種是植物乳桿菌，Ruiz-Barba等[16]報道在植物乳桿菌PLC25中發現多達16個天然質粒共存。然而，并不是所有乳桿菌都含有天然質粒，德氏乳桿菌似乎只在很少的菌株中存在天然質粒[17]。此外，乳桿菌中一些稀有菌種質粒分布情況的研究還很少見，顯然對這些菌種質粒的研究更有利于全面的認知乳桿菌屬天然質粒[18]。需要額外說明的是，在質粒研究早期，檢測質粒的方法多采用浮力密度梯度離心法[8]，該方法設備要求高，檢測效率低。現在普遍使用的瓊脂糖凝膠電泳法，雖然可以一次性檢測多個質粒，但被檢質粒大小限制于60 kb以內，更大的質粒多掩蔽于基因組DNA中[6]。近年，脈沖凝膠電泳法已經可以檢測102～104kb范圍大小的DNA[8]。因此以往研究檢測到的質粒數量可能遠被低估。

3 乳桿菌質粒的復制與調控

質粒是細胞中能夠自主復制的DNA分子，如果不考慮質粒大小，每個質粒都可以看作一個復制子。復制子幾乎是所有質粒上唯一且必備的遺傳單元，它決定著質粒的復制、分配、拷貝數、宿主范圍和不相容性等基本遺傳特性，因此復制子是研究質粒遺傳特征的核心區域。

3.1 質粒的復制類型

乳桿菌天然質粒復制存在2種基本復制類型：滾環（rolling-circle，RC）復制和theta（簡稱θ）復制。以往研究發現，乳桿菌大部分天然質粒屬于RC型復制質粒，θ型復制質粒數量較少，且質粒尺寸較大[6-7]。目前，乳桿菌RC型復制質粒已開展了較為廣泛的研究，并且由于這些質粒的寬宿主性質而得到了較為廣泛的應用[7]，但乳桿菌中θ型天然質粒的相關研究仍很匱乏。以往研究表明，RC型質粒復制過程中一個鮮明的特征是產生單鏈DNA中間體[19-20]，這一性質造成RC型質粒及其衍生載體在復制過程中容易發生重組和損傷，進而引起結構和遺傳穩定性降低。相反，θ型質粒在復制過程中不會產生單鏈DNA中間體，因此具有良好的結構穩定性和遺傳穩定性，并且在大基因片段插入時，仍能保持良好的穩定性[21]，更適合用于基因工程載體的構建。此外，以往研究認為，乳桿菌θ型復制質粒多為大型質粒，且宿主范圍很窄[22]，而近年研究發現，乳桿菌θ型復制質粒也可以較小[23-24]，并且可以同時在不同種、不同屬，甚至不同科的菌種中復制[25]。這表明，與RC型質粒相比，乳桿菌屬θ型質粒不但具備更好的結構和遺傳穩定性，而且同樣可以構建小型寬宿主載體。

3.2質粒復制調控機制

以往研究發現，雖然質粒的復制調控機制在不同復制類型、不同拷貝數、不同宿主菌和不同環境中表現出一定的多樣性、復雜性和差異性，但隨著越來越多質粒復制子DNA序列的解析，與質粒自身DNA相關的調控結構和編碼的調節蛋白已被發現，并顯示了一定程度的普遍性和同源性。目前質粒中發現存在兩種主要的復制調控機制和模型，即重復子（iteron）介導的Iteron/Rep調控模型和反義RNA（antisense RNA，asRNA）介導的Cop-asRNA-Rep調控模型[26]。重復子介導的調控機制發生在質粒復制的起始階段，并且普遍存在于含有rep和ori的質粒。asRNA介導的調控機制被認為在質粒復制起始后扮演著更加精細的調節作用，決定著質粒拷貝數的高低，并維持質粒拷貝數的穩定。目前該機制已發現4種調控模型：轉錄衰減、翻譯抑制、抑制引物成熟和抑制假結形成。4種調控模型的調控元件組成不同，例如有的質粒缺少Cop蛋白，有的質粒缺少Rep蛋白；4種調控模型的asRNA的大小、結構也各不相同。因此asRNA介導的調控機制模型很可能具有豐富的多樣性[27-31]。

目前，在NCBI的RefSeq數據庫可以檢索到165個乳桿菌質粒完整基因組。統計發現大多數乳桿菌質粒含有rep基因，這表明重復子介導的復制起始調控機制可能在乳桿菌質粒中同樣普遍存在，而在少數不含rep基因的質粒中可能存在新的復制起始調控機制。在一些報道中也存在著這樣的推測。例如嗜酸乳桿菌質粒pRKC30SC1[32]和植物乳桿菌質粒pG6303[33]、p256[34]、pLP9000[35]。這些質粒上的開放閱讀框架（open reading frame，ORF）編碼的蛋白與已知Rep蛋白沒有相似性，因此這些質粒可能不含有Rep蛋白，也可能含有一種未知的Rep蛋白。還有一些質粒含有1個以上具有活性的Rep蛋白，如植物乳桿菌質粒pMRI5.2[36]。這個質粒含有2個Rep蛋白，1個Rep蛋白與希氏乳桿菌質粒pLAB1000的Rep蛋白具有98%一致性，另一個Rep蛋白與乳球菌質粒pWVO1的Rep蛋白相似，而pLAB1000和pWVO1分屬于pC194和pMV158兩個不同的質粒家族，因此作者認為質粒pMRI5.2可能起源于兩個不同質粒。顯然，當1個質粒不含有Rep蛋白或含有1個以上Rep蛋白時，重復子介導的調控機制在這些質粒復制起始過程中很可能發揮著不一樣的調控機制，而新調控機制是如何進行的仍需要進一步的研究。

至今，在已測序乳桿菌質粒中已發現多個質粒含有推定的asRNA和/或調節蛋白基因，其中既有RC型質粒[37-39]，也有θ型質粒[40-41]。然而在這些質粒中，只有戊糖乳桿菌質粒p353-2編碼的asRNA經實驗證實對質粒repmRNA具有轉錄衰減作用，進而負調控質粒的復制[39]，而所有其他質粒編碼的asRNA和/或調節蛋白是否具有生理功能，以及它們具體的調控方式目前仍是未知的。因此，至今關于乳桿菌質粒asRNA介導的復制調控機制的研究很少，含有asRNA和/或調節蛋白基因的乳桿菌質粒普遍缺乏進一步的功能驗證和調控模型的研究。

4 乳桿菌質粒的功能

質粒功能取決于質粒除了編碼復制和維持系統必需基因外是否編碼了與表型有關的功能基因。雖然以往發現的乳桿菌質粒多數是功能未知的隱蔽性質粒，但隨著DNA測序技術的飛速發展，已經有越來越多的乳桿菌質粒基因組被測序和注釋，人們發現乳桿菌質粒既可以不編碼任何功能基因（例如小的隱蔽性質粒pLB925A01[42]），也可以編碼種類繁多的功能基因（例如巨型質粒pMP118[9]）。目前，在乳桿菌質粒上發現的眾多功能基因中，人們研究較多的主要有4類：蛋白酶基因[42-43]；糖、氨基酸和檸檬酸代謝基因[44-45]；細菌素、胞外多糖和色素合成基因[43-44,46]；抗生素、重金屬、噬菌體等脅迫因子抗性基因[47-49]。正是這些功能使乳桿菌在復雜環境和選擇壓力下，顯示了更強的生存優勢和更好的抗環境脅迫能力，因此深入研究質粒攜帶的這些功能基因對今后乳桿菌科學、理性的應用具有十分重要意義。

實際上，自從脈沖凝膠電泳發現了巨型質粒和小染色體以來，質粒和染色體之間的區別變得模糊不清，它們編碼的功能基因對宿主表型的區別也越來越有限。目前在乳桿菌中已有4個超過100 kb大小的質粒基因組完成了測序，它們分別是馬乳酒樣乳桿菌pWW1（194 kb）[50]和唾液乳桿菌pMP118（242 kb）[9]、pHN3（242 kb）[51]和pLS51A（143 kb）[14]。研究最清楚的巨型質粒pMP118中既有質粒獨有的復制起始蛋白和質粒分配基因，又有染色體中常見的糖代謝、氨基酸代謝、限制性內切酶、甲基化酶、拓撲異構酶基因，并且repE和groEL基因系統發生分析顯示巨型質粒與染色體具有相似的進化途徑[9]。這表明，乳桿菌巨型質粒與染色體相似，可以攜帶多樣性豐富的功能基因，這改變了以往乳桿菌質粒多為隱蔽性小質粒的結論[5-7]，為乳桿菌質粒及質粒功能研究提供了更廣闊的空間和可能性。

5 結 語

近年來，隨著高通量DNA測序技術的迅猛發展，基因組測序變得越來越便捷，這促使微生物學研究迅速進入了后基因組時代，乳桿菌及其質粒研究也迎來了新一輪的研究熱潮。目前乳桿菌屬共發現202個種、29個亞種（數據來自http://www.bacterio.net/ lactobacillus.html），其中有71個種、110個菌株完成了染色體基因組測序（數據來自NCBI的Genome數據庫），同時有23個種、165個質粒基因組也完成了測序（數據來自NCBI的RefSeq數據庫）。雖然乳桿菌已成為乳酸菌中測序質粒最多的屬，但測序質粒的乳桿菌種的數量僅占乳桿菌種總數量的11.38%（23/202），且測序質粒主要集中于常見的植物乳桿菌、短乳桿菌等6個種，這表明乳桿菌屬質粒資源仍有很大的挖掘空間，因此今后需要更加注重乳桿菌稀有菌種質粒分布情況的研究，進而可以更加全面、系統地認知乳桿菌屬質粒生物學特征。

前文已經提到，目前人們對乳桿菌質粒的復制調控機制進行的研究非常有限，對具體的調控過程知之甚少。實際上包括復制調控機制，人們對于乳桿菌質粒的分配、宿主范圍、不相容性、進化等基本遺傳特征都不甚了解，大部分機制問題都停留在DNA序列同源性的推測上，十分缺乏基于實驗的機理研究。相反，基于乳桿菌質粒功能進行的應用性研究開展較多，并在載體構建[7]、載體疫苗[52]等方面取得了可喜的進展。因此，今后乳桿菌質粒研究需要更加注重質粒遺傳機制的基礎性研究，因為只有質粒的復制、遺傳與進化機制清晰了，質粒功能及其應用才能發揮更大的效益，更好地為人類飲食和健康造福。

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Progress in Research on Natural Plasmids in Lactobacillus

SUN Daqing1,2, LI Hongfei1, SONG Dawei1, YANG Jian1,3, ZHANG Dongjie1,3, XU Xiaoxi2,*
(1. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 3. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Natural plasmids inhabiting some species ofLactobacilluscarry many important genes with biological functions and resistance to stress factors, and are significant for genetic, metabolic and evolutional studies ofLactobacillus. In this review, biological properties, distribution and functions of natural plasmids fromLactobacillusare summarized. The recent progress in research on replication types and regulatory mechanisms of plasmidsfromLactobacillusis discussed, and future research directions are also proposed. We hope that this paper can provide useful information and references for relevant researchers.

Lactobacillus; plasmid; replication; regulation; antisense RNA

Q939.97

1002-6630（2015）11-0251-05

10.7506/spkx1002-6630-201511047

2014-07-11

黑龍江省青年科學基金項目（QC2014C020）；黑龍江八一農墾大學大學生創新創業訓練計劃項目（xc2014041）

孫大慶（1979—），男，助理研究員，碩士，研究方向為食品微生物。E-mail：sundaqing1979@163.com

*通信作者：許曉曦（1968—），女，教授，博士，研究方向為畜產品加工。E-mail：xiaoxi_xu01@163.com