熱應激時奶牛血液中游離氨基酸流向與乳蛋白下降的關系研究

艾 陽，曹 洋，謝正露，張源淑*，沈向真

熱應激時奶牛血液中游離氨基酸流向與乳蛋白下降的關系研究

艾 陽，曹 洋，謝正露，張源淑*，沈向真

（南京農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)部動物生理生化重點開放實驗室，江蘇 南京 210095）

目的：探討熱應激時奶牛血液中氨基酸與乳蛋白的相互關系。方法：選取6頭相同泌乳期奶牛，正常飼喂和飲水，實驗期35 d（6月29日—8月5日）。每日10：00和18：00記錄氣溫，統(tǒng)計產(chǎn)奶量，每周取全天奶樣，F(xiàn)oss乳成分分析儀檢測乳蛋白含量。于實驗開始第1周和最后1周采集頸靜脈血液，反相高效液相色譜法檢測血液中游離氨基酸含量。結(jié)果：隨著氣溫的升高（由26℃升高至最高38℃），實驗奶牛日均產(chǎn)奶量由15.2 kg/d下降至10 kg/d，乳蛋白產(chǎn)量由0.47 kg/d下降至0.31 kg/d。血液中Glu、Asp、Gly和Val等主要的生糖氨基酸（參與糖異生作用）以及Leu、Ile等生酮氨基酸均升高或顯著升高（0.01＜P＜0.05）；總支鏈氨基酸（Val、Ile、Leu，主要參加免疫反應）含量顯著增加（P＜0.05），在必需氨基酸中所占的 比例由54.75%增至67.89%。結(jié)論：在夏季高溫高濕條件下，奶牛可發(fā)生熱應激，產(chǎn)奶量和乳蛋白含量均降低，但血液中游離氨基酸，特別是支鏈氨基酸含量顯著升高。提示熱應激時奶牛血液中高水平的游離氨基酸并未完全用于乳蛋白的合成，還發(fā)揮了除此之外的其他作用，而后者的作用優(yōu)先于參與乳蛋白的合成，即可能優(yōu)先作為功能性氨基酸參與了機體的其他活動。

熱應激；泌乳奶牛；乳；乳蛋白；血漿；游離氨基酸

熱應激是機體處于濕熱環(huán)境下的一種非特異性反應。許多研究表明，當氣溫高于22℃或溫濕指數(shù)（temperature-humidity index，THI）高于72時就會發(fā)生熱應激。熱應激會引起奶牛產(chǎn)奶量下降和乳品質(zhì)降低。研究表明，熱應激時期乳中蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)含量均降低，且乳脂水平為一年中最低[1]。高民等[2]研究發(fā)現(xiàn)，熱應激可導致奶牛飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化率下降。Shehab-El-Deen[3]、O’Brien[4]等研究認為熱應激可降低基礎循環(huán)中的葡萄糖含量，使血糖濃度顯著降低。熱應激也會抑制細胞和體液免疫，并會誘發(fā)諸如乳房炎、子宮內(nèi)膜炎、胎衣不下等疾病，是夏季奶業(yè)生產(chǎn)中面臨的主要問題[5-6]。近年來，隨著全球氣候變暖，熱應激情況愈發(fā)嚴重。尤其是在高溫高濕的中國南方，熱應激成為關鍵環(huán)境因素，嚴重制約著奶業(yè)發(fā)展。

乳蛋白是乳中總蛋白的總稱，約占乳中干物質(zhì)的90%，是構成乳重要營養(yǎng)品質(zhì)的主要物質(zhì)基礎。氨基酸是蛋白質(zhì)合成的基本原料，也是構成機體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì)。血液中氨基酸是乳蛋白的前體物和原料，其在血液中的含量決定著乳中蛋白質(zhì)的含量。已有文獻報道氨基酸適宜均衡的飼料有利于乳蛋白的合成[6]。另有研究表明氨基酸在血液中的變化反映了乳蛋白的變化，血液中氨基酸增加，乳蛋白的含量也增加[7]。因此，血液中氨基酸含量與乳蛋白合成之間的相互關系一直是備受關注的研究熱點。但目前仍未見熱應激條件下二者關系的詳細報道。本研究通過分析研究南京地區(qū)夏季6—8月高溫高濕氣候條件下，奶牛乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)的變化，從血液中乳蛋白前體物——氨基酸代謝變化的角度探討夏季熱應激情況下，乳蛋白下降與血液中游離氨基酸重分配間的相互關系，揭示其可能機制，以期為夏季奶牛合理飼養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）國藥集團化學試劑有限公司；β-巰基乙醇（2-mercaptoethanoic acid，β-ME）美國Sigma公司；甲醇（色譜級）德國默克公司；乙腈（色譜級）美國天地有限公司；四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF，色譜純）上海凌峰化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純。20種氨基酸標準品純度均大于98%，美國Holey教授饋贈。

Foss乳成分分析儀丹麥Hillerod公司；1100型安捷倫高效液相色譜儀（配有G1311A型液相流動泵，G1321A型紫外-可見檢測器）法國Agilent公司；WAT045905型C18色譜柱美國Waters公司；室溫檢測儀唐山現(xiàn)代工控技術有限公司；自動擠奶機淄博博山先鋒機械廠；集乳器余姚市宇海塑料制品有限公司。

1.2動物與飼養(yǎng)

6頭健康，體質(zhì)量（490±7）kg、分娩日期相近的泌乳期荷斯坦奶牛，飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學江浦畜牧獸醫(yī)實驗站（北緯32°93′，東經(jīng)119°82′）。采用Cornell-Penn-Miner System（NRC 2001）設計基礎日糧，飼料中青貯玉米為60%，苜蓿干草17%，精飼料23%，具體營養(yǎng)成分見表1。

飼喂期從6-8月為南京暑熱期間，維持35 d（2013年6月29日—8月5日）。6頭奶牛均飼養(yǎng)于開放式牛舍中，實驗期間自由飲水，每天分別于4：00、12：00和18：00喂給飼料并于奶牛采食完成后擠奶。

表1 日糧營養(yǎng)成分Table 1 Ingredients of dietss

1.3 氣溫測定

實驗期間每日氣溫紀錄采用室溫檢測儀，于上午10：00和下午18：00 2次測定，2次氣溫平均值記為每天日間氣溫。實驗期間日間氣溫介于26～38℃之間。

1.4產(chǎn)奶量和乳成分測定

產(chǎn)奶量：每天于奶牛進食后進行擠奶，擠奶采用自動擠奶機，集乳器收集后稱質(zhì)量，早中晚3次總和為每日產(chǎn)奶量。

乳蛋白含量測定：實驗期間每周周五采集全天乳樣，按體積比4∶3∶3將早、中、晚奶樣混合加入200μL飽和重鉻酸鉀作為全天乳樣，送至南京衛(wèi)崗乳業(yè)乳品檢測中心檢測。采用Foss乳成分分析儀檢測乳蛋白含量。

1.5血液樣品的采集與處理

血液樣品分別于實驗開始（0周）和第5周采集。采集采用真空抗凝管于奶牛進食后2 h收集每頭奶牛頸靜脈血液。采集的血液以3 000 r/ min離心15 min后，-20℃保存待測。

1.6血液中游離氨基酸的定量分析

采用OPA氨基酸柱前衍生法。反相高效液相色譜（reversed high performance liquid chromatography，RP-HPLC）儀：Kromasil C8柱；流動相：A為甲醇，B為乙腈；C為水，D為磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含3%四氫呋喃）。梯度洗脫，程序為10 min 9%A、6%B與85%D，10～25 min 12%A、8%B與80%D，25～40 min 15%A、15%B與70%D，40 min 30%A、25%B與45%D，直至最終洗脫完成。

樣品處理和操作方法按照張樹坤等[8]方法進行。流速為1 mL/min，激發(fā)波長為340 nm，紫外檢測波長450 nm，進樣量20 ?L。取樣品手工進樣進行色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1乳產(chǎn)量和氣溫變化

2.1.1氣溫變化

圖1 實驗期間每日氣溫和乳產(chǎn)量Fig.1 Average daily temperature and milk production during the experiment

由圖1可知，實驗前1周為適應期，飼喂實驗飼料，期間記錄每日氣溫。實驗第1周，環(huán)境氣溫保持在26℃左右。從第2周開始，日間平均氣溫劇烈上升，總體保持在32℃以上，在總共35 d的實驗期中，日間平均氣溫32℃以上持續(xù)時間達25 d，占實驗總天數(shù)的68.5%。整個實驗期間最高溫度為38℃，共計2 d。

一般認為THI高于72時奶牛就會發(fā)生熱應激[5]。根據(jù)THI公式和相關文獻[9]，當溫度達到32℃時奶牛會發(fā)生熱應激，由此可以認為本實驗設計中參試奶牛處于熱應激狀態(tài)。

2.1.2熱應激對乳產(chǎn)量的影響

由圖1可知，在實驗開始的前2周，產(chǎn)奶量迅速降低（由15.2 kg/d降至11.2 kg/d），而這一時間內(nèi)溫度由26℃上升至36℃。實驗中隨著熱應激的發(fā)生發(fā)展，產(chǎn)奶量不斷下降，最低為10 kg/d，僅為開始時的67%，下降了33%。乳產(chǎn)量隨著實驗期間溫度上升總體呈下降趨勢。

2.2熱應激對乳蛋白的影響

圖2 實驗期間乳蛋白變化Fig.2 Milk protein changes during the experiment

如圖2所示，乳蛋白含量在實驗前2周迅速下降，由3.08%下降至2.82%，其后3周含量又逐漸恢復至3.18%。由于在實驗過程中產(chǎn)奶量隨時間變化和溫度的升高不斷降低，隨后又統(tǒng)計了乳中蛋白質(zhì)的實際質(zhì)量，蛋白質(zhì)的實際質(zhì)量在前3周由0.47 kg下降至0.31 kg，后2周保持在較低水平。這種含量百分比與實際質(zhì)量之間相異的變化很可能是由于在7月份的高溫天氣下，奶牛排汗增多，產(chǎn)奶量下降，乳蛋白由于濃縮而升高了其含量百分比，而乳蛋白實際質(zhì)量是降低的。

2.3熱應激對血液中乳蛋白合成前體物氨基酸代謝流向的影響

圖3 實驗期間氨基酸變化Fig.3 AA changes during the experiment

由圖3可知，隨著實驗期的延長，血液中游離氨基酸中的必需氨基酸和非必需氨基酸含量均顯著增高。隨著溫度的升高，熱應激程度的加深，除Thr以外，血液中各游離氨基酸濃度均升高，Ser、Gly、Ala、Tyr、Val、Trp、Ile和Leu顯著升高（P＜0.05），其中支鏈氨基酸（Val、Ile、Leu，主要參與免疫反應）明顯升高（（198.37±52.58）～（1 474.85±355.83）?mol/L），從54.75%增至67.89%（P=0.024＜0.05），生酮氨基酸從（169.27±32.27）?mol/L升至（502.76±105.50）?mol/L（P=0.037＜0.05）。

3 討 論

THI是衡量熱應激的一個重要指標。根據(jù)已有研究結(jié)果[9]，當溫度達到32℃時，THI最低值為72，這一數(shù)值即為奶牛發(fā)生熱應激的最低THI。本實驗首先對南京地區(qū)夏季6月底至8月氣溫條件進行了監(jiān)測，得出整個實驗35 d期間牛舍的溫度數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在總共35 d的實驗期中，日間平均氣溫32℃以上持續(xù)時間達25 d，最高溫度為38℃。高溫持續(xù)期間THI遠遠超過72，即此實驗條件奶牛處于熱應激狀態(tài)。

20世紀30年代，人們就發(fā)現(xiàn)高溫可以引起產(chǎn)奶量下降。有研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度上升，奶產(chǎn)量會下降35%～40%[5]；另有研究證實，高溫與奶牛生產(chǎn)性能之間存在著負相關性[6]。Soriani等[10]研究發(fā)現(xiàn)當氣溫從21℃上升至38℃時，產(chǎn)奶量降低程度逐漸加強，38℃時產(chǎn)奶量僅為21℃的38.9%。本實驗結(jié)果表明，熱應激時實驗組中奶產(chǎn)量呈直線下降，奶產(chǎn)量的下降與溫度的升高呈明顯的負相關。這一結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致。

多年的研究證實，隨著溫度的上升，熱應激的程度加深，奶牛不僅產(chǎn)奶量減少，而且生鮮乳的品質(zhì)也降低。Regan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，氣溫達21.1℃時，生鮮乳的乳脂率有下降趨勢。Suchanek等[12]對10個品種的奶牛研究證實，在高溫環(huán)境條件下，各品種奶牛產(chǎn)奶的乳脂、乳蛋白、乳糖、乳干物質(zhì)、非脂干物質(zhì)和灰分水平均有所下降。何欽[9]研究發(fā)現(xiàn)，當氣溫從18℃上升到30℃時，乳蛋白含量下降16.9%。本研究顯示，乳蛋白含量在實驗的前2周迅速下降，由3.08%下降至2.82%，以后又逐漸回升，但其實際質(zhì)量在前3周由0.47 kg下降至0.31 kg，后2周保持在較低水平，總體熱應激時可引起乳蛋白降低。

關于熱應激時乳蛋白降低的機制的研究尚不多見，侯引緒等[13]認為，乳蛋白的降低可能是由于高溫導致了奶牛的蛋白進食量降低和皮膚的氮排泄增加造成的，但詳細的機制并沒有闡明。氨基酸是蛋白質(zhì)合成的原料。奶牛血液中氨基酸是乳蛋白合成的前體物和原料，其在血液中的含量決定著乳中蛋白的含量。已有文獻報道氨基酸適宜均衡的飼料有利于圍產(chǎn)期奶牛乳蛋白的合成[6]。張樹坤等[8]對泌乳山羊的研究證實，血液中氨基酸增加，乳蛋白的前體物也增加，乳蛋白含量增加。其在熱應激情況下，與乳蛋白的合成的關系如何，是否如圍產(chǎn)期奶牛或奶山羊一樣有利于乳蛋白的合成？尚沒有研究報道。為了證實這一推測，本實驗進一步檢測了實驗組各奶牛血液中游離氨基酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當奶牛處于熱應激時，其血液中游離氨基酸濃度均明顯升高，與以上的研究結(jié)果相反。另外，本結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，熱應激時奶牛血液中支鏈氨基酸（主要參與免疫反應，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝[14-16]），Glu、Asp、Gly和Val等主要的生糖氨基酸（參與糖異生作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)貯存，調(diào)節(jié)基因表達）[15-21]以及Leu、Ile等生酮氨基酸均顯著升高。提示熱應激時奶牛血液中高水平的游離氨基酸并未完全用于乳蛋白的合成，也就是說，奶牛機體處于熱應激情況下，血液中氨基酸除了發(fā)揮其作為前體物合成蛋白質(zhì)的作用外，還發(fā)揮了除此之外的其他作用，而后者的作用優(yōu)先于參與乳蛋白的合成。詳細機理有待進一步研究。

總之，我國夏季多呈高溫高濕天氣，奶牛熱應激程度嚴重，造成產(chǎn)奶量減少，生鮮乳質(zhì)量降低，深入揭示其影響機制和防控措施是十分重要的。

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Relationship between Free Amino Acids in Cow’s Blood and Decreasing Milk Protein under Heat Stress

AI Yang, CAO Yang, XIE Zhenglu, ZHANG Yuanshu*, SHEN Xiangzhen
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Heat stress is an unspecific reaction of the body in hot and moist environments. Many studies have demonstrated that heat stress can be formed at temperature over 22℃or temperature-humidity index higher than 72. In order to explore the relationship between free amino acids in plasma and milk protein synthesis under heat stress, we selected 6 dairy cows with similar parturition, regular diet and unlimited drink. The experiment lasted 35 days (from June 29 to August 5). The temperature (at 10:00 and 18:00) and milk yield were recorded. The protein content in whole-day milk sample was tested weekly by FOSS milk composition analyzer. Blood samples from jugular vein in both the first and last weeks were also collected. The free amino acid contents in blood samples were analyzed by RP-HPLC system. Our results showed that the milk yield decreased from 15.2 to 10 kg/d as the temperature rose from 26 to 38℃, while milk protein declined from 0.47 to 0.31 kg/d. In blood, Glu, Asp, Gly and Val, known as the main amino acids for gluconeogenesis, increased (0.01 ＜P＜ 0.05), so did Leu and Ile, known as the main amino acids for ketogenesis. The branch chain amino acids (Val, Ile and Leu) responsible for immune response increased significantly. In conclusion, in hot and moist environment, dairy cows were vulnerable to heat stress, which could cause reduction of milk production and milk protein synthesis, suggesting that the high level of blood amino acids could preferentially exert other functions besides milk protein synthesis under heat stress.

heat stress; lactating dairy cows; milk; milk protein; plasma; free amino acids

S827.5

1002-6630（2015）11-0038-04

10.7506/spkx1002-6630-201511008

2014-07-08

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（2011CB100802）

艾陽（1987—），男，碩士，主要從事動物機能生物化學研究。E-mail：Justin-ai@163.com

*通信作者：張源淑（1962—），女，教授，博士，主要從事乳蛋白生物活性肽和乳品質(zhì)研究。E-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn