張獻梅,程 力,2,*,洪 雁,2,顧正彪,2,李兆豐,2
馬鈴薯渣中淀粉組分抵抗α-淀粉酶降解的機制
張獻梅1,程 力1,2,*,洪 雁1,2,顧正彪1,2,李兆豐1,2
(1.江南大學食品學院,江蘇 無錫 214122;2.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,食品安全與營養協 同 創新中心,江蘇 無錫 214122)
從淀粉組分自身的性質以及其他組分對淀粉糊化、酶解作用的影響出發,研究馬鈴薯渣中淀粉組分抵抗α-淀粉酶降解的機制。對馬鈴薯渣中提取淀粉的性質研究表明:馬鈴薯渣中的淀粉和普通馬鈴薯淀粉具有相似的結構性質,其自身并不抵抗酶解。通過對馬鈴薯渣中其他組分對淀粉滲透、糊化影響的研究表明:其他組分對馬鈴薯渣中淀粉組分的包裹、阻隔作用使淀粉糊化以及和酶的作用受到阻礙,是影響淀粉酶解的主要因素。通過酶法預處理去除果膠、纖維素后對淀粉酶解效果的研究表明:去除果膠和纖維素后可解除其他組分對淀粉酶解的阻礙,且果膠對淀粉酶解的阻礙作用較大,纖維素次之。分別去除果膠、纖維素和同時去除兩種組分,可使所制備的馬鈴薯渣膳食纖維中淀粉的殘存量 由原來的20.63%分別降低到5.67%、15.70%和1.28%。
馬鈴薯渣;淀粉;抵抗酶解;纖維素;果膠
我國是世界上最大的馬鈴薯種植國,隨著我國馬鈴薯淀粉行業的發展,每年有大量的馬鈴薯被加工成淀粉,同時產生上百萬噸的濕薯渣。馬鈴薯渣是一種富含多種營養物的混合物,但濕渣中水分含量高且含有大量的微生物,極易腐敗變質,造成環境污染[1]。因此,開發一種濕馬鈴薯渣的有效綜合利用方式,對馬鈴薯淀粉行業的發展和解決日益嚴峻的環境問題都具有重要的價值。
馬鈴薯渣中膳食纖維含量高達50%~60%,其中可溶性膳食纖維占14%~15%[2],是一種高品質的膳食纖維原料。膳食纖維的生理功效是明顯而肯定的,包括預防便秘與結腸癌、調節血脂、調節血糖以及減肥等。隨著人們對健康的關注程度越來越高,膳食纖維的需求量也越來越大[3]。因此,以馬鈴薯渣為原料制備膳食纖維將成為馬鈴薯渣開發利用的一種有效方式。
王卓等[2]采用α-淀粉酶去除馬鈴薯渣中淀粉組分制備馬鈴薯渣膳食纖維(potato pulp dietary fi ber,PDF),但產品PDF中淀粉 殘存量高達25%~26%。Thomassen等[4]采用耐熱α-淀粉酶去除濕馬鈴薯渣中淀粉組分,淀粉最高去除率為21%~22%,殘存量也高達20%~22%,采用AOAC 985.29《食物中總膳食纖維 酶-重量法》測定膳食纖維的方法去除淀粉,去除率為23.2%,殘存量也高達21%。與馬鈴薯渣膳食纖維相比,小麥麩皮膳食纖維中淀粉殘存量僅為5.7%[5],玉米皮和米糠膳食纖維中淀粉殘存量均小于3%[6-7]。馬鈴薯渣中淀粉組分表現出了抵抗α-淀粉酶降解的性質,淀粉難以被酶解,過高的淀粉殘存量影響了PDF的品質,限制了其應用,也導致以馬鈴薯渣為原料制備膳食纖維的綜合利用技術無法得到推廣和應用。
本實驗以濕馬鈴薯渣中的淀粉組分為研究對象,從馬鈴薯渣中淀粉組分自身的性質和其他組分對淀粉糊化、酶解作用的影響出發,研究其抵抗α-淀粉酶降解的機制,確定馬鈴薯渣膳食纖維制備過程中抑制淀粉酶解的主要因素,為以馬鈴薯渣為原料制備高品質膳食纖維提供理論參考和技術支持。
1.1 材料與試劑
濕馬鈴薯渣由內蒙古奈倫集團提供。
α-高溫淀粉酶(酶活力20 000 U/mL) 無錫杰能科生物工程有限公司;果膠酶(酶活力3 800 U/mL)、纖維素酶(酶活力700 U/mL) 美國Sigma-Aldrich集團;其他試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。
1.2 儀器與設備
SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博泰實驗設備有限公司;WFJ2000分光光度計 上海尤尼柯公司;Pyris 1型差示掃描量熱儀 美國PE公司;D8 Advance型X衍射分析儀 德國Bruker AXS公司;Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientifi c公司;LC-20AT型高效液相色譜儀 日本島津公司;OLYMPUS-BX41熱臺光學顯微鏡 日本奧林巴斯公司。
1.3 方法
1.3.1 馬鈴薯渣中淀粉組分的提取
參照李濤等[8]的水酶法提取青稞淀粉工藝研究,將馬鈴薯渣中淀粉的提取工藝修改確定如下:馬鈴薯渣→纖維素酶、果膠酶處理(樣品-水(1∶10,m/V),pH 4.8,50 ℃,4 h)→過篩→離心→洗滌→40 ℃烘干。
1.3.2 α-高溫淀粉酶酶解效果測定[9]
分別準確稱量1 g自提馬鈴薯渣淀粉、普通馬鈴薯淀粉(精確到0.1 mg),按樣品與磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)1∶5(m/V)加入緩沖液,搖勻,加入150 U/g α-高溫淀粉酶,160 r/min、95 ℃在水浴恒溫振蕩器中反應30 min。酶水解產物經4 500 r/min離心10 min得到酶水解液,3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法測定水解液中還原糖含量[10],計算α-高溫淀粉酶酶解率。酶解率計算公式如下[11]。
式中:m0為還原糖質量/g;m為淀粉質量/g;C為淀粉水分含量/%。
1.3.3 結晶結構分析
自提馬鈴薯渣淀粉、普通馬鈴薯淀粉研磨過100 目篩后,采用X射線衍射儀(X-ray diffractometer,XRD)觀察其晶體結構。測試條件如下:衍射角(2θ)以4 °/min的掃描速率從4 °升到40 °。X射線衍射圖譜通過MDI Jade 5.0軟件進行分析[12]。
1.3.4 熱力學特性分析
采用差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC)分別對自提馬鈴薯渣淀粉、普通馬鈴薯淀粉的熱力學特性進行測試。分別準確稱量1.0 mg上述兩種樣品(精確到0.1 mg),按樣品-水(1∶2,m/m),加入去離子水并混合均勻。以空皿為參比,掃描溫度從20 ℃到100 ℃,掃描速率為10 ℃/min[12]。
1.3.5 馬鈴薯渣中淀粉組分糊化過程中淀粉滲透量的測定[13]
樣品制備:準確稱量一定量的濕馬鈴薯渣和自提馬鈴薯渣淀粉,加水至淀粉質量分數為6%(以干質量計),置于三角瓶中,于指定溫度(50、60、70、80、90、100 ℃)水浴恒溫振蕩器中糊化30 min,轉速為 200 r/min。取出后立即轉移至離心管,以6 000 r/min離心 30 min,取上清液備用。
測定方法:稱取100 mg馬鈴薯直鏈淀粉于三角瓶內,加入1 mol/L的NaOH 9 mL,95%的乙醇1 mL,隨后在沸水浴中加熱15 min,冷卻后以蒸餾水轉移至100 mL容量瓶內,并定容至刻度。吸取上述溶液2.5 mL于50 mL棕色容量瓶中,加入1 mol/L HCl 0.5 mL及碘液1 mL,用蒸餾水定量至刻度,避光靜置20 min,在 620 nm波長處測定吸光度,繪制標準曲線;以相同的方法測定樣品上清液,計算淀粉滲透量。淀粉滲透量的計算公式如下。
式中:m1為滲透出的淀粉質量/mg;m為樣品中淀粉質量/g;C為樣品水分含量/%。
1.3.6 馬鈴薯渣中淀粉組分糊化過程顆粒形貌分析
配制馬鈴薯渣淀粉懸濁液(質量分數1%)與馬鈴薯渣混合液(淀粉組分質量分數約1%),將制備好的樣品置于熱臺中,用硅膠黏合劑密封,以防止水分在加熱過程中的揮發,并以2 ℃/min的升溫速率加熱到100 ℃,光學顯微鏡(10×50)下觀察,并采集圖象[14]。
1.3.7 馬鈴薯渣中果膠、纖維素和淀粉之間的氫鍵作用分析
樣品制備:稱取一定質量的濕馬鈴薯渣5 份,按樣品-磷酸鹽緩沖液(pH 4.8)1∶5(m/V)加入緩沖液,搖勻;分別加入40 U/g果膠酶(2 份)、50 U/g纖維素酶(2 份)和40 U/g果膠酶-50 U/g纖維素酶混合酶(1 份),在50 ℃水浴恒溫振蕩器中160 r/min分別反應1、4、4 h,即分別去除馬鈴薯渣中的果膠、纖維素、果膠和纖維素。向果膠酶和纖維素酶處理過的樣品中(其中1 份)加入1 mol/L NaOH調解pH值至6.0,加入150 U/g α-高溫淀粉酶,95 ℃在水浴恒溫振蕩器中160 r/min反應30 min,即分別去除馬鈴薯渣中的果膠和淀粉、纖維素和淀粉。酶水解后真空抽濾、濾渣冷凍干燥[15],制備出主要成分分別為纖維素/淀粉、果膠/淀粉、淀粉、纖維素、果膠的樣品。
測定方法:取適量的溴化鉀和樣品,研磨充分,壓片法制備薄片,使用傅里葉紅外光譜儀測試。條件如下:以空氣為參比 ,掃描波數范圍為4 000~500 cm-1,掃描次數為32 次,通過Omnic8.0軟件分析結果[12]。
1.3.8 酶法預處理后馬鈴薯渣中淀粉組分的酶解效果分析
預處理方法:稱取一定質量的濕馬鈴薯渣,按樣品-磷酸鹽緩沖液(pH 4.8)1∶5(m/V)加入緩沖液,搖勻;分別加入40 U/g果膠酶、50 U/g纖維素酶和40 U/g果膠酶-50 U/g纖維素酶混合酶,在50 ℃水浴恒溫振蕩器中160 r/min反應1、4、4 h[15]。即分別去除馬鈴薯渣中的果膠、纖維素、果膠和纖維素,酶解結束后,沸水浴15 min滅酶。
α-高溫淀粉酶酶解:取預處理后的馬鈴薯渣,1 mol/L NaOH調節pH值至6.0,加入150 U/g α-高溫淀粉酶,在95 ℃水浴恒溫振蕩器中160 r/min反應30 min。酶水解產物經4 500 r/min離心10 min,移除上清液,測定殘渣中淀粉殘存量,淀粉含量測定方法參照GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》。用淀粉殘存量表征馬鈴薯渣中淀粉組分的酶解效果。
1.4 數據分析
2.1 馬鈴薯渣中淀粉組分理化性質的研究
抗性淀粉具有抵抗α-淀粉酶降解的特性。Xu Shasha等[16]通過XRD、DSC研究了抗性淀粉的微觀結構、結晶結構和熱力學性質,曹力心[17]研究了馬鈴薯渣抗性淀粉的抗酶解性,結果表明抗性淀粉在這些理化性質方面和普通淀粉存在顯著差異,結晶結構的變化和淀粉顆粒的完整性是影響淀粉酶解特性的主要因素。本實驗將馬鈴薯渣中的淀粉單獨提取出來,對其理化性質進行分析[18],研究淀粉組分自身是否抵抗酶解。
2.1.1 α-高溫淀粉酶酶解效果分析

表1 馬鈴薯渣淀粉和馬鈴薯淀粉酶解率Table 1 Hydrolysis rates of potato pulp starch and potato starch
單獨對自提馬鈴薯渣淀粉和普通馬鈴薯淀粉進行酶解分析,結果如表1所示,兩種淀粉的酶解率不存在顯著性差異(P>0.05);且還原糖含量均在60%以上,而馬鈴薯抗性淀粉采用耐高溫α-淀粉酶95 ℃酶解24 h,還原糖含量僅為2.1%[17],明顯低于馬鈴薯渣淀粉經酶解后的還原糖含量;可以判定馬鈴薯渣淀粉自身不抵抗酶 解。
2.1.2 結晶結構分析結果

圖1 自提馬鈴薯渣淀粉和普通馬鈴薯淀粉的X射線衍射圖Fig.1 X-ray diffraction patterns of potato pulp starch and potato starch
變性淀粉抵抗酶解的一個主要原因是淀粉的結晶結構加固、結晶度增大[16]。由圖1可知,自提馬鈴薯渣淀粉和普通馬鈴薯淀粉均呈現尖峰衍射和彌散衍射特征,可見兩種淀粉顆粒均由結晶區和非結晶區兩部分組成,屬于多晶體系,在2θ為5.6 °、15 °、17.2 °、19.5 °、22.2 °、24 °處出現了明顯的尖峰衍射,都屬于典型的B型晶體結構。且自提馬鈴薯渣淀粉和普通馬鈴薯淀粉具有相近的結晶度,分別為32.06%和31.87%,不存在顯著性差異(P>0.05)。綜合分析自提馬鈴 薯渣淀粉與普通馬鈴薯淀粉的晶體結構與結晶度,均沒有明顯差別,這與自提馬鈴薯渣淀粉不抵抗酶解的結果一致。
2.1.3 熱力學特性分析結果
淀粉糊化是一個一級相變過程,差示掃描量熱法可用于測定淀粉發生糊化的相轉變溫度(T0、TP)、轉換溫度范圍(TC-T0)和所需的吸熱焓(ΔH)。其中,ΔH主要代表了淀粉相變過程中雙螺旋結構的解聚及熔融所需的能量,從而反映出淀粉的糊 化度[19]。淀粉結晶區周圍的無定形區會影響T0、TP、TC的變化,主要反映了淀粉的結構和結晶度,TC-T0反映淀粉內部的結晶體完善程度、晶體大小差異情況,TC-T0越大,說明淀粉內部結晶體的差異程度越大[20]。

表2 自提馬鈴薯淀粉與普通馬鈴薯渣淀粉熱力學參數Table 2 DSC thermal characteristics of potato starch and potato pulp sttaarrcchh
表2顯示了自提馬鈴薯渣淀粉和普通馬鈴薯淀粉的熱力學特性參數,統計分析表明自提馬鈴薯渣淀粉的吸熱峰沒有明顯變寬,T0、TP、TC、ΔH均沒有明顯增加。自提馬鈴薯渣淀粉和普通馬鈴薯淀粉表現出了相近的熱力學性質,具有相近的糊化性質和結晶性質。
綜合比較自提馬鈴薯渣淀粉與普通馬鈴薯淀粉的酶解效果、結晶特性、熱力學特性,表明自提馬鈴薯渣淀粉組分在形態結構及酶解特性方面均和普通馬鈴薯淀粉沒有顯著差異。說明自提馬鈴薯渣淀粉組分本身不具有抵抗酶解的性質,淀粉難以被酶解的原因可能是底物復雜的組成,果膠、纖維素等組分阻礙了淀粉的酶解。
2.2 馬鈴薯渣中其他組分對淀粉組分理化性質的影響
2.2.1 馬鈴薯渣中其他組分對淀粉組分糊化過程中淀粉滲透量的影響
淀粉可溶性組分在糊化過程中的滲透量可以反映淀粉糊化的難易程度[13]。馬鈴薯渣中淀粉可溶性組分在糊化過程中的溶出會受到其他非淀粉組分的影響。

圖2 馬鈴薯渣中其他組分對淀粉滲透量的影響Fig.2 Effects of other componen ts on the amount of starch polymer molecules leaching in potato pulp
由圖2可知,對單獨的自提馬鈴薯渣淀粉而言,淀粉可溶性組分的滲透量隨著溫度的升 高而增大,其中,在70~100 ℃溫度范圍內顯著增加。70~80 ℃范圍內淀粉滲透量升高主要是由于淀粉分子攝取大量水分、迅速膨脹,結晶結構被破壞,導致大量淀粉可溶性組分溶出。80~100 ℃范圍內淀粉滲透量升高是由于進一步的水化與加熱使得淀粉顆粒結構內的支鏈淀粉雙螺旋解聚,淀粉的剛性喪失,顆粒輪廓逐漸消失,淀粉可溶性組分進一步滲透出來[13]。與單獨的自提馬鈴薯渣淀粉相比,馬鈴薯渣體系中每克淀粉中淀粉滲透量較低,且與單獨淀粉不同,馬鈴薯渣體系中淀粉滲透量在80~100 ℃溫度范圍內的增加較為顯著,說明馬鈴薯渣體系中其他組分對淀粉的溶出、滲透有阻礙作用。可能是纖維素、果膠組分與淀粉顆粒之間存在纏繞、包裹,影響淀粉顆粒與水的接觸、阻礙淀粉的滲透,影響了淀粉的糊化。
2.2.2 馬鈴薯渣中其他組分對淀粉組分糊化的影響

圖3 自提馬鈴薯渣淀粉分子糊化過程光學顯微鏡圖(×50000)Fig.3 Microscopic images for the gelatinization process of potato pulp starch molecules (×500)


圖4 濕馬鈴薯渣中淀粉分子糊化過程光學顯微鏡圖(×50000)Fig.4 Microscopic images for the gelatinization process of starch in wet potato pulp (×500)
用熱臺光學顯微鏡連續觀察同一視野內自提馬鈴薯渣淀粉和濕馬鈴薯渣中淀粉的糊化過程。由圖3可知,60~65 ℃時,已有少量淀粉分子吸水潤脹,溫度升高到68 ℃,淀粉分子在水和熱的作用下迅速膨脹,繼續升溫到70~80 ℃,淀粉分子繼續膨脹并伴隨著結構崩解,使得淀粉顆粒逐漸失去原形,只剩下最外層的一個不成形的空囊,90 ℃以上淀粉分子的輪廓已基本消失,完全糊化。由圖4可知,溫度低于65 ℃時,濕馬鈴薯渣中淀粉基本保持淀粉分子的完整性,溫度升高到65~70 ℃,淀粉分子剛開始出現少量吸水潤脹,繼續升溫到72~85 ℃,淀粉分子在水和熱的作用下才迅速膨脹,但仍保持淀粉顆粒的原形,直至升溫到100 ℃,大量的淀粉分子仍未發生崩解,糊化不徹底。對比圖3和圖4可知,馬鈴薯渣中其他組分對淀粉的膨脹糊化存在明顯的抑制作用,導致淀粉難以糊化。可能是馬鈴薯渣中的主要成分纖維素和果膠包裹、纏繞在淀粉周圍,并且在糊化過程中能夠束縛體系中水分子的移動,使參與糊化的水分子減少,造成淀粉不能充分吸水膨脹[21]。結合圖2~4推測果膠和纖維素是阻礙淀粉組分酶解的主要因素。
2.2.3 馬鈴薯渣中纖維素、果膠與淀粉組分之間的氫鍵作用
由圖5可知,馬鈴薯渣中各組分在3 742~3 002 cm-1處都有一個較寬且吸收較強的吸收峰,這是羥基(—OH)的特征峰,說明薯渣中存在著締合狀態的氫鍵。纖維素、果膠和淀粉的羥基峰出現在3 415 cm-1,果膠/淀粉的羥基峰向3 403 cm-1移動,纖維素/淀粉 的羥基峰向3 407 cm-1移動。羥基峰向低波數移動,說明氫鍵增強,即果膠、纖維素和淀粉之間存在氫鍵作用,且果膠和淀粉之間氫鍵更強[22]。這進一步證實了馬鈴薯渣中纖維素、果膠組分與淀粉之間存在相互作用,阻礙水與淀粉的接觸,抑制了淀粉的糊化以及淀粉酶對淀粉的可及性,從而使得淀粉表現出抵抗酶解的性質。
上述研究結果表明,馬鈴薯渣中的纖維素和果膠組分對淀粉的酶解具有重要的影響。因此,采用果膠酶和纖維素酶去除馬鈴薯渣中果膠、纖維素兩種組分,解除上述組分對淀粉酶解的阻礙作用,同時也探索提高淀粉酶解效果的有效方法。
2.2.4 酶法預處理對馬鈴薯渣中淀粉組分酶解效果的影響

表3 果膠、纖維素對淀粉酶解效果的影響Table 3 Influence of pectin and cellulose on enzymatic degradation of starch
由表3可知,采用果膠酶和纖維素酶去除馬鈴薯渣中果膠和纖維素組分后,α-高溫淀粉酶酶解效果明顯提高,淀粉組分殘存量由原來的20.63%分別降低到5.67%、15.70%和1.28%,即去除果膠、纖維素后淀粉酶解效果顯著提高,進一步證明了果膠和纖維素組分是影響淀粉酶解的主要因素,去除果膠和纖維素后能夠解除非淀粉組分對淀粉酶解的阻礙。同時,酶法預處理的結果表明,果膠對淀粉酶解的阻礙作用較大,纖維素次之,這可能是果膠作為一種親水膠體和黃原膠等親水膠體一樣,能夠包裹在淀粉顆粒表面,阻礙淀粉的溶出擴散,并且在糊化過程中能夠束縛體系中水分子的移動,使參與糊化的水分子減少[13]。果膠親水膠體的性質使其成為馬鈴薯渣中淀粉組分難以滲透、糊化不完全的最主要因素,而纖維素對淀粉的包裹纏繞及相互作用力較弱(圖5),所以纖維素對淀粉酶解的阻礙作用弱于果膠。
自提馬鈴薯渣淀粉和普通馬鈴薯淀粉具有基本一致的結晶形態、糊化特性和酶解效果,其自身不抵抗酶解;馬鈴薯渣中果膠和纖維素組分與淀粉之間形成氫鍵,對淀粉具有包裹作用,阻礙了淀粉的滲透溶出、糊化以及和酶的接觸,使得馬鈴薯渣中的淀粉組分表現出了抵抗酶解的性質,且果膠對淀粉酶解的阻礙作用較大,纖維素次之;通過預處理分別去除馬鈴薯渣中果膠、纖維素以及同時去除這兩種組分可使酶法制得的馬鈴薯渣膳食纖維中淀粉殘存量由原來的20.63%分別降低到5.67%、15.70%和1.28%,極大地提高了淀粉的去除效率。
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Mechanism of Potato Pulp Starch Resistance to α-Amylase Degradation
ZHANG Xianmei1, CHENG Li1,2,*, HONG Yan1,2, GU Zhengbiao1,2, LI Zhaofeng1,2
(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
In order to study the mechanism of potato pulp starch resistant to enzymatic degradation, the nature of starch itself and the impact of other components on enzymatic degradation of starch were investigated. First, potato pulp starch was extracted and its physicochemical properties were examined. The results showed that potato pulp starch itself had no resistance to hydrolysis. Second, the impact of other components on the penetration and gelatinization of starch was studied. As a result, the gelatinization of potato pulp starch was suppressed by other components. Then, the pectin and cellulose were removed by pectinase and cellulose, respectively. These results showed that the starch could be hydrolyzed well after removing pectin and cellulose, and the obstruction by pectin was stronger than by cellulose. The content of residual starch in potato pulp was reduced from the original level of 20.63%to 5.67%, 15.70%and 1.28%after pectin, cellulose and both components were re moved, respectively.
potato pulp; starch; resistance to enzymatic hydrolysis; cellulose; pectin
TS239
A
10.7506/spkx1002-6630-201511011
2014-08-08
廣東省專業鎮中小微企業服務平臺建設專項資金項目(2012B091400030)
張獻梅(1988—),女,碩士研究生,研究方向為淀粉科學與工程。E-mail:dearxianmei@163.com
*通信作者:程力(1984—),男,工程師,碩士,研究方向為淀粉深加工。E-mail:chenglichocolate@163.com