植物乳桿菌分子伴侶蛋白基因在鹽脅迫下的表達分析

烏日娜，宋雪飛，劉倩穎，徐 鑫，王茜茜，武俊瑞,*

植物乳桿菌分子伴侶蛋白基因在鹽脅迫下的表達分析

烏日娜1,2，宋雪飛1，劉倩穎1，徐 鑫1，王茜茜1，武俊瑞1,*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866；2.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

以一株分離篩選自東北自然發酵大醬中的耐鹽植物乳桿菌FS5-5為實驗對象，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應技術，在轉錄水平上對其分子伴侶蛋白的相應基因在鹽脅迫下的表達進行研究。結果表明：在菌體對數生長期，分子伴侶蛋白調控系統中，基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp均受MRS培養基中NaCl的誘導而表達上調，并且NaCl的質量濃度越高，基因受誘導表達上調越顯著，而hsp3雖受MRS培養基中NaCl的誘導表達有所上調，但其受誘導表達上調顯著程度與NaCl質量濃度不呈正相關。

植物乳桿菌；實時熒光定量聚合酶鏈式反應；鹽脅迫；基因表達

植物乳桿菌是乳酸桿菌的一種短桿菌，菌體成對或成鏈狀排列分布，不產芽孢，厭氧或兼性厭氧，革蘭氏陽性菌，最適pH值為6.5左右[1]。植物乳桿菌是公認的益生菌，植物乳桿菌代謝產物中，除氨基酸、短肽、乳酸外，還有多種有機酸、過氧化氫、細菌素、雙乙 酰等諸多天然抑菌物質[2]。植物乳桿菌具有諸多生理功能，包括：營養作用、改善胃腸道功能、抗腫瘤作用、增強機體免疫力、降低膽固醇、平衡泌尿生殖系統菌群[3-4]。

在乳酸菌制品生產加工過程中，會經歷高溫殺菌、噴霧干燥等高溫處理環節，這些處理會對菌體本身產生不同程度的迫害作用。熱應激反應所涉及的主要蛋白質是分子伴侶蛋白（molecular chaperon），例如GroEL/GroES、DnaK、DnaJ，以及蛋白酶（如HtrA、FtsH、Clp）。這類蛋白質的基因在菌體處于正常生長環境中時不表達或表達受抑制，但當菌體受到熱或外界環境變化時，則會被激活而表達以保護菌體細胞[5]。鹽脅迫對菌體有很大的影響，例如鹽脅迫所引起的環境滲透壓的突然增加，使細胞內的水分外流，引起細胞膨壓的損失，改變胞內溶質的濃度和細胞體積[6]。

鹽脅迫對益生嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種菌體、益生乳酸桿菌都有一定的影響[7-9]。目前，很多關于滲透壓脅迫的研究主要關注的是滲透壓上升后，立即通過積累相容性溶質的方式來恢復膨壓。然而，關于鹽脅迫下蛋白基因的表達情況的信息是有限的。熱應激蛋白是普遍存在于所有種類生物中的分子伴侶蛋白，為了保護菌體細胞，熱應激蛋白很有可能會對鹽脅迫造成的高滲透壓環境做出應激反應。在研究這些蛋白質在鹽脅迫中的重要性時，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，real time-PCR）技術成為重要的技術工具[10]。

植物乳桿菌是在食品及其他領域應用最為廣泛的發酵微生物，研究其發酵機理并對其發酵條件進行優化具有重要的實踐意義。本實驗以一株分離自東北自然發酵大醬樣品中的具有耐鹽特性的植物乳桿菌FS5-5[11]為實驗菌株，并對其在NaCl質量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL 4 個梯度下，生長至對數生長期的分子伴侶蛋白相關基因的表達進行了研究，以期為進一步開發耐鹽性發酵菌種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：從東北自然發酵大醬中分離篩選出一株耐鹽的植物乳桿菌FS5-5。

液體Man, Rogosa and Sharp（MRS）培養基（100 mL）：牛肉浸膏0.8 g、蛋白胨1 g、酵母粉0.4 g、無水乙酸鈉0.3 g、葡萄糖2 g、吐溫-80 0.1 g、K2HPO40.2 g、MgSO4·7H2O 0.058 g、檸檬酸鈉0.2 g、MnSO4·H2O 0.019 g、蒸餾水100 mL。

RNAprep Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、Real Master Mix（SYBR Green）熒光定量PCR試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

DNP-9080型生化培養箱 上海振宇化工科技有限公司；CR-21G型高速冷凍離心機 日本日立公司；5418R小型臺式冷凍離心機 上海研謹生物科技有限公司；NANODROP 8000濃度儀 美國熱電集團；ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR儀 美國應用生物系統公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 河南兄弟儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體收集

MRS培養基中NaCl的質量濃度分別為0、3、6、9 g/100 mL，分別取5 mL于若干試管中，蓋上試管塞，121 ℃滅菌20 min。待試管中培養基冷卻到室溫后，在無菌操作臺上，于無菌條件下用移液槍分別吸取100 ?L活化二代的菌液于上述各鹽質量濃度試管中。于37 ℃恒溫箱中培養，分別于接種后第8、10、10、12小時收集對數期菌體。

1.3.2 提取總RNA

按照天根生化科技（北京）有限公司RNAprep Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒說明書提取菌體總RNA。

1.3.3 合成cDNA第一鏈

按照天根公司TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.3.4 引物設計與合成方法

本實驗確定管家基因為16S rRNA，目的基因為熱激蛋白調控系統（groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、hsp3、usp）。在GenBank網站查詢全部管家基因和目的基因的序列，引物設計軟件為Primer 5。引物送上海百力格生物技術有限公司合成。管家基因和目的基因的引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers for quantitative PCR

1.3.5 real time-PCR擴增實驗

按照天根生化科技（北京）有限公司Real Master Mix（SYBR Green）熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR實驗。

PCR反應體系（20 μL）：熒光染料混合液9 μL、cDNA模板2 μL、正向引物2 μL、反向引物2 μL、超純水5 μL。

PCR擴增條件：變性：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 33 s，68℃ 34 s，循環40 次；熔解曲線：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。

1.4數據分析

作圖軟件為Excel，用軟件SPSS 19.0進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 MRS培養基中的NaCl對基因groEL、groES、dnaK、dnaJ表達的影響

圖1 1基因ggrrooEELL、groES、dnaK、dnaJ、uusspp、hsp1、hsp2、hsp3受NaCl誘導表達情況Fig.1 Expression of genes induced by NaCl

由圖1A～1D可以看出，隨著NaCl質量濃度的增加，基因groEL、groES、dnaK、dnaJ受誘導程度也隨之增加。與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調；與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調，且與NaCl質量濃度為3 g/100 mL比較，表達差異顯著（P＜0.05）；與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調，且與NaCl質量濃度為3、6 g/100 mL比較，表達差異顯著（P＜0.05）。

Kilstrup等[12]的研究表明，對于乳酸乳球菌，大多數鹽脅迫誘導蛋白也被熱脅迫所誘導。分子伴侶蛋白DnaK、GroEL和GroES受2.5 g/100 mL NaCl的誘導，表達上調了5～9 倍。Meury等[13]對大腸桿菌的研究表明，30 ℃添加NaCl條件下，K+吸收和去質壁分離過程中，DnaK蛋白質水平大幅度增加。他們從一株野生型大腸桿菌分離出蛋白，利用免疫印跡法對DnaK蛋白質水平進行分析，發現在添加NaCl后1～5 min時間里，DnaK蛋白質水平上升了2～3 倍。蛋白質的穩定增長反映了合成速率的大幅度增長。根據以上研究，乳酸乳球菌和大腸桿菌的分子伴侶蛋白基因在鹽脅迫下將會表達上調，使分子伴侶蛋白的合成量增加。本實驗中，對于植物乳桿菌，分子伴侶蛋白基因groEL、groES、dnaK、dnaJ也受NaCl的誘導而表達上調，并且NaCl的質量濃度越高，基因受誘導表達上調越顯著，可見這些基因的誘導表達程度與NaCl質量濃度呈正相關。

2.2 MRS培養基中的NaCl對基因usp表達的影響

由圖1E可知，隨著NaCl質量濃度的增加，基因usp受誘導程度也隨之增加。與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調；與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調，且與NaCl質量濃度為3 g/100 mL比較，表達差異顯著（P＜0.05）；與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調，且與NaCl質量濃度為3、6 g/100 mL比較，表達差異顯著（P＜0.05）。

Usp為通用應激蛋白（universal stress protein），通常被好幾種脅迫誘導，參與DNA或蛋白質修復[14]。在不利的環境壓力下，Usps的產量增加，并且通過一系列的機制來幫助微生物生存[15]。黃桂東[16]應用蛋白質組學技術，對乳酸菌Lactobacillus brevis NCL912在酸脅迫下菌體蛋白質的變化進行了研究，結果表明：酸脅迫誘導通用應激蛋白UspA表達上調。宋維志等[17]的研究表明，當培養基鹽度高于最適鹽度時，無論溫度高低，南極適冷菌Psychrobacter sp.G的一個通用應激蛋白（USP）基因usp1141的表達均會提高。本實驗中，對于植物乳桿菌，分子伴侶蛋白基因usp也受NaCl的誘導而表達上調，因此蛋白Usp的產量增加，以便更好地起到修復蛋白的作用。并且NaCl的質量濃度越高，基因受誘導表達上調越顯著，可見基因usp的誘導表達程度與NaCl質量濃度呈正相關。

2.3 MRS培養基中的NaCl對基因hsp1、hsp2、hsp3表達的影響

由圖1F、1G可知，隨著NaCl質量濃度的增加，基因hsp1、hsp2受誘導程度也隨之增加。與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調；與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調，且與NaCl質量濃度為3 g/100 mL比較，表達差異顯著（P＜0.05）；與NaCl質量濃度為 0 g/100 mL比較，在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調，且與NaCl質量濃度為3、6 g/100 mL比較，表達差異顯著（P＜0.05）。

由圖1H可知，隨著NaCl質量濃度的增加，基因hsp3受誘導程度并沒有呈規律性變化。與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，基因hsp3在含有3 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調；與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，基因hsp3在含有6 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調；與NaCl質量濃度為0 g/100 mL比較，基因hsp3在含有9 g/100 mL NaCl MRS培養基中受到誘導，表達上調。

Hsp1、Hsp2、Hsp3為小熱激蛋白sHsp。小熱激蛋白以動態低聚物的復合物形式存在，并且有多種生物學功能[18]。小熱激蛋白與大分子質量熱激蛋白，都具有分子伴侶作用，能修復蛋白質、阻止蛋白質錯誤折疊[19-21]，但仍然缺乏對其統一分子機制的理解[22]。Yeh等[23]的研究表明，重組的大腸桿菌細胞表達了一種大小為16.9 kD的小熱激蛋白Oshsp16.9后，耐熱性增強。本實驗中，對于植物乳桿菌，分子伴侶蛋白基因hsp1、hsp2也受NaCl的誘導而表達上調，因此蛋白Hsp1、Hsp2的產量增加，以便更好地起到修復蛋白的作用。并且NaCl的質量濃度越高，基因受誘導表達上調越顯著，可見基因hsp1、hsp2的誘導表達程度與NaCl質量濃度呈正相關。然而基因hsp3雖受NaCl誘導表達上調，但誘導表達程度與NaCl質量濃度的關系不呈正相關。環境滲透壓的升高，影響蛋白質的生物活性、結構和功能[24-25]，基因hsp3結構本身及其表達的蛋白Hsp3可能也受滲透壓的影響，但具體機理有待進一步的研究。

3 結 論

分子伴侶蛋白基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp、hsp3受到NaCl脅迫時均受到誘導表達上調，分子伴侶蛋白的量提高。環境滲透壓的升高，影響蛋白質的生物活性、結構和功能，分子伴侶蛋白通過調節蛋白質修復和折疊作用，從而保護蛋白質的形態、功能特性，這便是分子伴侶蛋白的作用機理。基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp的誘導表達程度與NaCl質量濃度呈正相關，即NaCl的質量濃度越高，基因受誘導表達上調越顯著。說明這些基因本身及合成的蛋白都能耐受鹽脅迫。而基因hsp3面對不同強度的滲透壓脅迫時，雖表達均有上調，但變化趨勢與NaCl質量濃度不呈正相關。面對高質量濃度NaCl帶來的滲透壓脅迫，基因hsp3結構本身或其表達的蛋白Hsp3受到了破壞，不能全面發揮其修復蛋白的作用；或者是Hsp3的功能與植物乳桿菌的耐鹽性相關性不是很高，但具體機理還有待進一步的研究。

[1] 王水泉, 包艷, 董喜梅, 等. 植物乳桿菌的生理功能及應用[J]. 中國農業科技導報, 2010, 12(4): 49-55.

[2] 靳志強, 王延樣. 植物乳桿菌在人體腸道的益生特性[J]. 中國乳品工業, 2007, 35(9): 30-34.

[3] PIEPER R, JANCZYK P, URUBSCHUROV V, et al. Effect of Lactobacillus plantarum on intestinal microbial community composition and response to enterotoxigenic Escherichia coli challenge in weaning piglets[J]. Livestock Science, 2010, 133(1): 98-100.

[4] 張佳程, 駱承庠. 乳酸菌對食品中膽固醇脫除作用的研究[J]. 食品科學, 1998, 19(3): 20-22.

[5] GUCHTE M V D, SERROR P, CHERVAUX C, et al. Stress responses in lactic acid bacteria[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 82(1/4): 187-216.

[6] ANGELIS M D, GOBBETTI M. Environmental stress responses in Lactobacillus: a review[J]. Proteomics, 2004, 4(1): 106-122.

[7] KIM W S, PERL L, PARK J H, et al. Assessment of stress response of the probiotic Lactobacillus acidophilus[J]. Current Microbiology, 2001, 43: 346-350.

[8] GOUESBET G, JAN G, BOYAVAL P. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus thermotolerance[J]. Dairy Science and Technology, 2001, 81: 301-309.

[9] DESMOND C, STANTON C, FITZGERALD G F, et al. Environmental adaptation of probiotic lactobacilli towards improvement of performance during spray drying[J]. International Dairy Journal, 2002, 12(2/3): 183-190.

[10] 張立國, 張琚. 實時定量PCR技術的介紹[J]. 生物技術, 2003, 13(2): 39-40.

[11] 徐鑫, 王茜茜, 王曉蕊, 等. 傳統農家大醬中耐鹽性乳酸菌的分離與鑒定[J]. 食品與發酵工業, 2014, 40(11): 33-40.

[12] KILSTRUP M, JACOBSEN S, HAMMER K, et al. Induction of heat shock proteins DnaK, GroEL and GroES by salt stress in Lactococcus lactis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(5): 1826-1837.

[13] MEURY J, KOHIYAMA M. Role of heat shock protein Dnak in osmotic adaption of Escherichia coli[J]. Journal of Bacteriology, 1991, 173(14): 4404-4410.

[14] VERGES M C, MAGUIN E, MISTOU M Y, et al. Lactic acid bacteria and proteomics: current knowledge and perspectives[J]. Journal of Chromatography B, 2002, 771(1/2): 329-342.

[15] TKACZUK K L, SHUMILIN I A, CHRUSZCZ M, et al. Structural and functional insight into the universal stress protein family[J]. Evolutionary Applications, 2013, 6(3): 434-449.

[16] 黃桂東. Lactobacillus brevis NCL912的耐酸特性及其酸脅迫下差異表達蛋白的研究[D]. 南昌: 南昌大學, 2011.

[17] 宋維志, 林學政, 車帥. 南極適冷菌 Psychrobacter sp. G普遍脅迫蛋白(USP)基因的克隆及其脅迫條件下的應答特征分析[J]. 海洋科學進展, 2013, 31(1): 145-152.

[18] VERTII A, HAKIM C, KOTLYAROV A, et al. Analysis of properties of small heat shock protein Hsp25 in MAPK-activated protein kinase2(MK2)-defi cient cells[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(37): 26966-26975.

[19] ELLIS R J. Molecular chaperones: the plant connection[J]. Science, 1990, 250: 954-959.

[20] YEH C H, CHEN Y M, LIN C Y. Functional regions of rice heat shock protein, Oshsp16.9, required for conferring thermotolerance in Escherichia coli[J]. Plant Physiology, 2002, 128(2): 661-668.

[21] JINN T L, CHIU C C, SONG W W, et al. Azetidine-induced accumulation of class I small heat shock proteins in the souble fraction provides thermotolerance in soybean seedlings[J]. Plant and Cell Physiology, 2004, 45(12): 1759-1767.

[22] HASLBECK M, FRANZMANN T, WEINFURTNER D, et al. Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins[J]. Nature Structural and Molecular Biology, 2005, 12(10): 842-846.

[23] YEH C H, CHANG P F, YEH K W, et al. Expression of a gene encoding a 16.9-kDa heat-shock protein, Oshsp16.9, in Escherichia coli enhances thermotolerance[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997, 94(2 0): 10967-10972.

[24] TRAN K, MAY B K, SMOOKER, et al. Distribution and genetic diversity of lactic acid bacteria fr om traditional fermented sausage[J]. Food Research International, 2011, 44(1): 338-344.

[25] PADAN E, BIBI E, ITO M, et al. Alkaline pH homeostasis in bacteria: new insights[J]. Biochimica et Biophysica Act a(BBA)-Biomembranes, 2005, 1717(2): 67-88.

Expression of Chaperone Protein Genes in Lactobacillus plantarum under Salt Stress

WU Rina1,2, SONG Xuefei1, LIU Qianying1, XU Xin1, WANG Qianqian1, WU Junrui1,*
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The objective of this study was to isolate a salt-tolerant Lactobacillus plantarum (FS5-5) from naturally fermented miso in northeastern China. The expression of chaperone protein genes under salt stress at the transcriptional level was evaluated by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (real time-PCR). Results showed that in the exponential growth phase, the chaperone protein genes such as groEL, groES, dnaK, dnaJ, hsp1, hsp2, and usp were induced by NaCl in MRS medium and their expressions were up-regulated. The higher NaCl concentration was, the more significant the up-regulation was. Similarly, the heat shock protein gene hsp3 was induced by NaCl in MRS medium and its expression was up-regulated, but the induced up-regulation was not positively correlated with NaCl concentration.

Lactobacillus plantarum; real-time fl uorescence quantitative polymerase chain reaction (real time-PCR); salt stress; gene expression

Q93

A

10.7506/spkx1002-6630-201511019

2014-11-25

國家自然科學基金青年科學基金項目（31000805）；國家自然科學基金面上項目（31471713）；

中國博士后科學基金資助項目（2014M560395）；遼寧省農業領域青年科技創新人才培養資助計劃項目（2014048）；

沈陽農業大學“天柱山英才支持計劃”項目

烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：wrn6956@163.com

*通信作者：武俊瑞（1977—），男，副教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：junruiwu@126.com