響應面法優化黃酒釀造工藝

崔 闖，任 清*

響應面法優化黃酒釀造工藝

崔 闖，任 清*

（北京工商大學食品學院，北京 100048）

以小米為原料，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法對小米黃酒的釀造工藝進行優化。結果表明：回歸方程擬合性好，在酒曲添加量0.9%、糖化時間63 h、糖化溫度31 ℃、酵母添加量0.39%、發酵溫度32 ℃、發酵時間5 d時為最佳釀造條件。在此最優條件下，驗證優化工藝得到最大糖度、最小酸度及最大酒精體積分數分別為17.25%、0.377 1和12.10%，與模型預測值17.26%、0.377 3和12.00%無顯著性差異，表明通過響應面法優化的回歸方程具有一定的實踐指導意義。

小米；黃酒；響應面法；釀造工藝

谷子為五谷之一，屬禾本科，狗尾草屬，起源于我國，是世界上古老的農產品之一[1]，谷子脫殼后為小米，其具有生育期短、適應性廣、價格低廉等優點[2-4]。小米的營養豐富[5]，含有豐富的碳水化合物、蛋白質、氨基酸、脂肪酸、維生素及礦物質等[6]，且各種營養物質比例適宜，是一種良好的營養源[7]，但多年以來人們對小米的食用方法比較單一，對小米的深加工研究也一直沒有引起足夠的重視[8-17]，因此，為小米資源的深加工開辟新途徑具有重要意義。黃酒是我國特有的傳統酒種，是世界上最古老的三大釀造酒之一[18]，隨著人們物質文化生活水平的日益提高，消費者對黃酒這一產品的要求也不斷提高，黃酒的營養價值和口感越來越受到消費者的普遍重視[19]。

本實驗以小米作為釀造原料，采用Box-Behnken響應面法得到其制備黃酒的最優釀造條件，旨在為實現小米資源的開發利用及黃酒新產品的開發提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

小米：“張雜谷7號”由張家口市農業科學院提供。

酒曲、酵母 湖北安琪生物集團有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設備

THZ-D臺式恒溫振蕩器 蘇州市培英實驗設備有限公司；T-6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；SHP-250型生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；Allegra 64r臺式高速冷凍離心機 美國Beckman公司；酒精計 河間市雙塔儀表廠。

1.3實驗方法

1.3.1小米黃酒釀造工藝流程

1.3.2理化指標測定

還原糖含量的測定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色定糖法[20]；酸度的測定[21]：分別從發酵醪的上層、中層、下層3點取樣并混合均勻，再取混合之后的樣品10 g，放于研缽中研磨成勻漿，之后加入100 mL無CO2的水，攪拌均勻后靜置30 min，期間攪拌一次，取上清液用已標定的0.1 mol/L的NaOH溶液進行滴定。酒精體積分數、總糖、總酸、非糖固形物、氨基酸態氮的測定：均參照GB/T 13662—2008《黃酒》[22]中相關指標的方法測定。

1.3.3感官評定方法

從釀造的黃酒中取樣并進行感官評價，主要指標為外觀、香氣、口味和風格四方面。

1.3.4統計分析方法

每個單因素試驗在相同的試驗條件下重復操作3次，對驗證實驗結果采用方差分析方法比較結果與預測值之間的顯著性差異。

1.4影響小米黃酒糖化工藝的單因素試驗

1.4.1加曲量對小米黃酒糖化效果的影響

向蒸熟淋冷后的小米中分別添加0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的酒曲，攪拌均勻后搭窩，于30 ℃條件下糖化48 h后，取樣測定其糖度和酸度。

1.4.2糖化時間對小米黃酒糖化效果的影響

向蒸熟淋冷后的小米中添加0.8%的酒曲，攪拌均勻后搭窩，于30 ℃條件下分別糖化24、36、48、60、72 h后，取樣測定其糖度和酸度。

1.4.3糖化溫度對小米黃酒糖化效果的影響

向蒸熟淋冷后的小米中添加0.8%的酒曲，攪拌均勻后搭窩，分別于20、25、30、35、40 ℃條件下糖化60 h后，取樣測定其糖度和酸度。

1.5響應面法優化小米黃酒糖化工藝

在單因素試驗結果的基礎上，選擇加曲量、糖化時間及糖化溫度為響應面優化的考察因素，并以-1、0、1分別代表因素的水平，以糖化結束的黃酒糖度及酸度為響應值，設計三因素三水平的響應面分析試驗。

1.6影響小米黃酒發酵工藝的單因素試驗

1.6.1酵母添加量對小米黃酒發酵效果的影響

向一定量經過糖化的小米中，分別添加0.18%、0.25%、0.32%、0.39%和0.46%的酵母，攪拌均勻后于35 ℃條件下發酵3 d，確定產酒量并測定酒液的酒精體積分數、總糖及總酸含量。

1.6.2發酵溫度對小米黃酒發酵效果的影響

向一定量經過糖化的小米中添加0.39%的酵母攪拌均勻后，分別于29、32、35、38、41 ℃條件下發酵3 d，確定產酒量并測定酒液的酒精體積分數、總糖及總酸含量。

1.6.3發酵時間對小米黃酒發酵效果的影響

向一定量經過糖化的小米中添加0.39%的酵母攪拌均勻后，于32 ℃條件下分別發酵2、3、4、5、6 d，確定產酒量并測定酒液的酒精體積分數、總糖及總酸含量。

1.7響應面法優化小米黃酒發酵工藝

在單因素試驗結果的基礎上，選擇酵母添加量、發酵溫度及發酵時間為響應面優化的考察因素，并以-1、0、1分別代表因素的水平，以發酵結束的黃酒酒精體積分數為響應值，設計三因素三水平的響應面分析試驗。

2 結果與分析

2.1糖化工藝單因素試驗及結果

2.1.1加曲量對小米黃酒糖化效果的影響

圖1 酒曲添加量對糖化效果的影響Fig.1 Effect of koji concentration on saccharification efficiency

由圖1可知，隨著酒曲添加量的增加，糖度逐漸增加，當酒曲添加量為0.6%～1.0%時，糖度變化不大，酸度則呈現先升高再降低，最后又升高的過程。黃酒屬于開放式發酵，發酵過程中來自環境中的微生物也會進入發酵醪中參與發酵，如果糖化速率過快，產酸菌就會大量繁殖，導致酸度升高[23]。在糖度變化不大的條件下考察酸度，酸度高則會影響黃酒品質，故加曲量存在最適用量，綜合考慮，加曲量取0.8%較合適。

2.1.2糖化時間對小米黃酒糖化效果的影響

由圖2可知，隨著糖化時間的延長，糖度不斷增加，在糖化時間為60 h時，糖度達到最大值，酸度隨著糖化時間的延長呈現上升的趨勢。糖化時間短，小米含有的淀粉未得到充分水解，隨著糖化時間的延長，小米中的淀粉被不斷水解轉化為糖，糖度不斷增加，當糖化時間超過60 h時，糖度呈下降趨勢，酸度呈上升趨勢，說明糖化已進行的比較徹底，產酸菌的比重增加。綜合考慮，糖化時間為60 h較合適。

圖2 糖化時間對糖化效果的影響Fig.2 Effect of saccharification time on saccharification efficiency

2.1.3糖化溫度對小米黃酒糖化效果的影響

圖3 糖化溫度對糖化效果的影響Fig.3 Effect of saccharification temperature on saccharification efficiency

由圖3可知，一開始糖度隨著溫度的升高而增加，當溫度為30 ℃時達到最大值，之后則隨著溫度的升高呈下降趨勢，酸度則隨著溫度的升高呈現先降低后升高的趨勢。分析原因可知，溫度低時糖化速率慢，雜菌生長競爭力強，導致樣品酸度很高；隨著溫度的升高，酒曲對淀粉水解程度增加，糖度升高，酸度降低；當溫度超過酒曲的最適溫度時，酒曲的活性降低，從而使糖化效果變差，嗜熱產酸菌活力更強，導致樣品酸度上升，最終確定最適糖化溫度為30 ℃，這與現有相關研究結論一致[24]。

2.2響應面優化糖化工藝試驗結果及分析

響應面法優化小米黃酒糖化工藝的試驗結果見表1。通過Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗進行回歸分析，預測小米黃酒糖化的最優工藝參數，方差分析結果見表2、3。

對表1中的試驗數據進行多元回歸擬合后，分別得到各因素水平對黃酒糖化糖度（Y1）與黃酒糖化酸度（Y2）影響的二次多項回歸模型：

分別對兩種模型采用二次型進行變異分析，方程的相關系數分別為R12=0.992 5，R22=0.920 1，說明兩種模型擬合程度均較好，可以用于小米黃酒糖化工藝實驗的預測。

表1 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 1 Box-Behnken design with experimental values of sugar content and aciddiittyy

表2 以糖度為響應值回歸模型的方差分析Table 2 Analysis of variance of sugar content

由表2、3可知，方程（1）中除AB與A2項無顯著影響外，其他項對糖度的影響達到極顯著水平（P＜0.01）；方程（2）中C項和C2項對酸度的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。另外，在選定的實驗范圍內，各因素對試驗結果的重要性與F值的大小呈正比，各因素對糖度及酸度的影響大小順序均為糖化溫度＞糖化時間＞加曲量。

表3 以酸度為響應值回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of acidity

2.3小米黃酒糖化工藝條件驗證

采用Design Expert 8.0.6.1統計軟件聯合求解模型方程（1）和（2），得出小米黃酒糖化的最優工藝參數：酒曲添加量0.9%、糖化時間63.1 h、糖化溫度31.67 ℃。為了檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優化參數進行小米黃酒的糖化。考慮到實際操作的便利，將小米黃酒糖化工藝參數優化為酒曲添加量0.9%、糖化時間63 h、糖化溫度31 ℃，根據此最優參數進行小米黃酒的糖化（n=3）。結果表明，平均糖度為17.25%，預測值為17.26%，經顯著性方差分析，P=0.373 9＞0.05，可以認為實驗結果與預測值之間無顯著性差異，平均酸度為0.377 1，預測值為0.377 3，經顯著性方差分析，P=0.101 2＞0.05，可以認為實驗結果與預測值之間無顯著性差異，表明該模型可以較好地反映出小米黃酒糖化工藝條件，采用Box-Behnken響應面法優化小米黃酒糖化工藝結果可靠。

2.4發酵工藝單因素試驗及結果

2.4.1酵母添加量對小米黃酒發酵效果的影響

圖4 酵母添加量對發酵效果的影響Fig.4 Effect of yeast concentration on fermentation efficiency

如圖4所示，隨著酵母添加量的增大，產酒量呈現先升高后緩慢降低的趨勢，酒精體積分數逐漸升高，并在添加量0.39%時達到最大，而后逐漸下降，其原因可能是較高添加量的酵母菌完成自身繁殖需要消耗大量的糖類物質，致使發酵液中轉化為酒精的糖度降低，從而使酒精體積分數偏低，因此酵母添加量為0.39%較合適，表4顯示各組酒液的總酸及總糖值均符合黃酒標準。

表4 酵母添加量對小米黃酒指標的影響Table 4 Effect of yeast concentration on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.4.2發酵溫度對小米黃酒發酵效果的影響

圖5 發酵溫度對發酵效果的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on fermentation efficiency

由圖5可知，當發酵溫度為29～35 ℃時酒樣的酒精體積分數差別不大，當發酵溫度超過35 ℃時酒精體積分數降低。這是因為酵母的活性存在最適溫度，溫度過高或過低都會抑制酵母的活性[25]，進而影響發酵效果，結合出酒量考慮發酵溫度為32 ℃較合適，表5顯示各組酒液的總酸及總糖均符合黃酒標準。

表5 發酵溫度對小米黃酒指標的影響Table 5 Effect of fermentation temperature on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.4.3發酵時間對小米黃酒發酵效果的影響

圖6 發酵時間對發酵效果的影響Fig.6 Effect of fermentation time on fermentation efficiency

由圖6可知，一開始隨著發酵時間的延長，酒精體積分數迅速增加，當發酵時間超過4 d之后酒精體積分數的增加趨于平緩，可能是因為糖化液中大部分的還原糖已被酵母轉化為酒精[26]，產酒量則在發酵第5天時達到最大，從生產上考慮，選擇發酵5 d最為合適，表6顯示各組酒液的總酸及總糖均符合黃酒標準。

表6 發酵時間對小米黃酒發酵指標的影響Table 6 Effect of fermentation time on sensory and chemical indicators of millet yellow wine

2.5 響應面優化發酵工藝試驗結果及分析

表7 小米黃酒發酵工藝優化試驗設計及結果Table 7 Response surface design with experimental values of alcohol content

對表7中試驗數據進行多元回歸擬合后，得到各因素水平對黃酒酒精體積分數（Y）影響的二次多項回歸模型：

對該模型采用二次型進行變異分析，方程的相關系數R2=0.901 2，說明該模型擬合程度較好，可以用于小米黃酒發酵工藝實驗的預測。

響應面法優化小米黃酒發酵工藝的試驗結果見表7。通過Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗結果進行回歸分析，預測小米黃酒發酵的最優工藝參數，方差分析結果見表8。

表8 以酒精體積分數為響應面結果的方差分析Table 8 Analysis of variance of alcohol content

由表8可知，方程（3）中A2項對酒精體積分數的影響達到顯著水平（P＜0.05），B2項和C2項對酒精體積分數的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。另外，在選定的實驗范圍內，各因素對試驗結果的重要性與F值的大小呈正比，從表8中可以推斷出各因素對酒精體積分數的影響大小順序是：發酵時間＞發酵溫度＞酵母添加量。

2.6小米黃酒發酵工藝條件驗證

通過Design Expert 8.0.6.1統計軟件求解模型方程（3），得出小米黃酒發酵的最優工藝條件：酵母添加量0.39%、發酵時間4.85 d、發酵溫度32.36 ℃。為了檢驗響應面法所得結果的可靠性，采用上述優化條件進行小米黃酒的發酵，考慮到實際操作的便利，將小米黃酒發酵工藝參數優化為酵母添加量0.39%、發酵時間5 d、發酵溫度32 ℃，根據此最優參數進行小米黃酒糖化（n=3）。結果顯示，平均酒精體積分數為12.10%，預測值為12.00%，經顯著性方差分析，P=0.287 9＞0.05，可以認為實驗結果與預測值之間無顯著性差異，說明該模型可以較好地反映出小米黃酒發酵工藝條件，采用Box-Behnken響應面法優化小米黃酒發酵工藝的結果可靠。

3 結 論

本實驗在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面分析法對小米黃酒釀造工藝進行了優化，并對試驗結果進行了數學模擬和預測。最終確定了小米黃酒釀造的最優參數：酒曲添加量0.9%、糖化時間63 h、糖化溫度31 ℃、酵母添加量0.39%、發酵時間5 d、發酵溫度32 ℃。各因素對響應值均有極顯著影響，采用該條件進行驗證實驗，得到的平均糖度、酸度和酒精體積分數分別為17.25%、0.377 1和12.10%，經方差分析，與預測值均無顯著性差異，綜合回歸模型分析及驗證實驗，采用響應面法對小米黃酒釀造工藝進行優化方法可行，得出的最優釀造工藝具有一定的實際應用價值，以小米為原料釀造黃酒開發前景廣闊。

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Process Optimization for the Production of Chinese Yellow Wine by Response Surface Methodology

CUI Chuang, REN Qing*
(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

In this study, millet was used to produce yellow wine by saccharification and subsequent fermentation. The production process was optimized using combination of single factor method and response surface methodology. A well-fitted regression model equation was established using Box-Behnken design. The results showed that the optimal conditions for producing Chinese yellow wine were found to be saccharification at 31℃for 63 h after addition of 0.9%koji followed by fermentation at 32℃for 5 d after inoculation of 0.39%yeast. Under these conditions, the maximum sugar content, the minimum acidity and the maximum alcohol content (by volume) of millet yellow wine were observed to be 17.25%, 0.377 1 and 12.10%, agreeing with the predicted values (17.26%, 0.377 3 and 12.00%). Key words: millet; yellow wine; response surface methodology; production process

TS262.4

1002-6630（2015）11-0134-06

10.7506/spkx1002-6630-201511026

2014-07-03

公益性行業（農業）科研專項（201303069-07）

崔闖（1990—），女，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：cc19901011@163.com

*通信作者：任清（1969—），男，副教授，博士，研究方向為生物活性成分的分離提取及功能。E-mail：renqing@th.btbu.edu.cn