植物性食品原料中異黃酮形成機理及富集的影響因素

焦彩鳳，楊潤強，顧振新*

植物性食品原料中異黃酮形成機理及富集的影響因素

焦彩鳳，楊潤強，顧振新*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

異黃酮屬酚類物質，是苯丙烷類的次生代謝產(chǎn)物，大多存在于豆科植物中，對人體具有廣泛生理調節(jié)功能。本文綜述植物性食品原料中異黃酮形成的機理，以及基于環(huán)境誘導和基因改造層面調控異黃酮合成途徑中的關鍵酶編碼基因表達，最終誘導異黃酮積累的技術。

異黃酮；形成機理；富集；影響因素

異黃酮是植物次生代謝產(chǎn)物，對人體具有多種生理和藥理活性。研究表明異黃酮可與雌激素受體結合，在動物和人體內通過與在下丘腦、腦下垂體，肺、胸腺等組織中表達的雌激素受體（estrogen receptor，ERβ）結合，產(chǎn)生類雌激素作用[1]。流行病學調查顯示，富含異黃酮的飲食能夠預防癌癥，尤其是性激素依賴性的乳腺癌、前列腺癌和肺癌等[2]。異黃酮還有調節(jié)免疫系統(tǒng)、防治過敏癥與結腸炎等免疫紊亂疾病的功能[3]。口服異黃酮制劑能改善絕經(jīng)后女性血管內皮功能[4]。異黃酮能夠防治骨質疏松癥，可減少骨質丟失，促進骨生成[5]。然而大豆、銀杏、歐芹等植物性食品原料中異黃酮提取率較低。采用生物技術處理后，可促進異黃酮合成途徑中的關鍵酶基因的轉錄和表達，最終誘導異黃酮積累。本文綜述植物食品原料中異黃酮富集機理及技術研究現(xiàn)狀，以期為富含異黃酮的食品原料開發(fā)利用提供參考。

1 異黃酮形成機理及其富集的影響因素

1.1異黃酮形成機理

高等植物中異黃酮的合成從底物苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）開始，經(jīng)由苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸:輔酶A連接酶（4-coumarate CoA-ligase，4CL）催化的一系列酶促反應，生成前體p-香豆酰-CoA。p-香豆酰-CoA在查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）和查耳酮還原酶（chalcone reductase，CHR）的催化下生成柚皮素查耳酮或異甘草素。柚皮素查耳酮或異甘草素在查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下生成柚皮素或甘草素。柚皮素或甘草素在異黃酮合酶（isoflavone synthase，IFS）的催化下生成大豆異黃酮游離苷元如染料木黃酮、黃豆苷元和黃豆黃素，隨后在不同的葡萄糖基轉移酶催化下，生成相應的結合型異黃酮[6]，具體過程見圖1。

圖1 大豆異黃酮的生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of soybean isoflavones

異黃酮合成途徑中的關鍵酶包括PAL、CHS、CHI和CHR。PAL作為苯丙烷類合成途徑的起始酶，可將初生代謝產(chǎn)物轉化為大量的次生代謝產(chǎn)物，因而其催化活性直接影響整個途徑效率[7]。CHS是類黃酮合成途徑中第一個特異性關鍵酶。X射線衍射表明：CHS晶體結構為兩個42 kD多肽的同源二聚體，每個單體有兩個結構域，活性位點位于結構域的裂縫[8]。CHS基因表達受光照、生物鐘、溫度、6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）和赤霉素A3（gibberellin A3，GA3）及P蛋白等調控[9]。CHI基因家族包含8個成員，分為CHI1、CHI2、CHI3和CHI4這4個亞家族[3]。基于催化能力，CHI基因可進一步分為Ⅰ型和Ⅱ型CHI，I型CHI與類黃酮合成有關，Ⅱ型CHI則與異黃酮合成有關[7]。IFS是將黃烷酮代謝途徑引入異黃酮代謝途徑的關鍵酶，其作用的底物柚皮素是黃烷酮代謝途徑中許多酶的競爭性底物，如在類黃酮3-羥化酶（flavonoids 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）的催化下形成黃烷酮醇，在黃酮合成酶（flavone synthase，F(xiàn)NS）催化下形成黃酮。因而IFS與黃烷酮代謝途徑中許多酶相互作用必然會影響異黃酮的合成[10]。

1.2影響異黃酮富集的因素

1.2.1生長環(huán)境

植物中異黃酮的積累受環(huán)境因素調控。生長環(huán)境中光照[11]、水分[12]、茉莉酸甲酯[13]等外界信號被植物細胞膜上的受體所識別并結合，引起膜通透性、細胞氧化還原態(tài)和細胞超微結構變化等一系列反應，從而引起細胞核內基因表達量發(fā)生變化，異黃酮合成途徑中關鍵酶結構及其活性發(fā)生變化，最終調控異黃酮合成。此過程需要通過植物細胞內Ca2+、環(huán)鳥甘酸（guanosine 3’,5’-cyclic phosphate，cGMP）、激酶、一氧化氮（nitric oxide，NO）等第二信使系統(tǒng)的關鍵組分將誘導信號級聯(lián)放大。

1.2.2基因改造

隨著分子生物學技術的廣泛應用，次生代謝工程能有效調控異黃酮的合成。目前已有的方法主要基于以下機理：1）過量表達限速酶，導致終產(chǎn)物含量的增加，這是植物代謝工程最常用的策略之一；2）通過引入轉錄調控因子，調節(jié)多個基因的共同表達，協(xié)調控制整個代謝途徑；3）提高植物次生代謝途徑中某一分支代謝途徑中酶活性，使其在與另一分支代謝途徑的競爭中占據(jù)優(yōu)勢，以提高目標代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，例如抑制與IFS競爭同一底物（柚皮素）的F3H和FNS可促進異黃酮的積累[14]。

2 異黃酮富集技術

在對異黃酮合成途徑中關鍵酶及富集機理有較為清晰認識的基礎上，科學工作者已將一些富集異黃酮的技術應用于研究中。

2.1光誘導

光是植物生長發(fā)育中一個重要的環(huán)境信號。目前的研究多集中于光對植物類黃酮合成中的一個重要的限速酶——苯基苯乙烯酮合酶基因CHS的誘導作用，該反應信號轉導的一些可能組分已被揭示。顯微注射和藥理學方法研究表明，西紅柿種子和大豆細胞培養(yǎng)物中光敏色素信號轉導通路調節(jié)CHS表達[15]。活化的光敏色素A（phytochromeA，phyA）將光信號轉化為三聚體G蛋白和第二信使（包括cGMP和酪氨酸激酶）。與光敏信號通路不同，cGMP和酪氨酸激酶不影響紫外光B波段（ultraviolet-B，UV-B）調節(jié)CHS的表達。鈣、鈣調蛋白和絲氨酸激酶等拮抗物顯著影響UV-B調節(jié)CHS的轉錄，但不抑制光敏色素對CHS基因表達的調節(jié)[15]。

2.1.1光質

紅光照射雖能顯著促進發(fā)芽大豆的生長，但抑制發(fā)芽大豆PAL活性和異黃酮合成。Kirakosyan等[16]的研究表明，紅光照射僅對實驗選擇的5種基因型大豆中的一種產(chǎn)生作用，且遠紅外光（750 nm峰值透射率）比紅外光（650 nm峰值透射率）更能促進大豆的芽和根中葛根素、染料木素、黃豆苷元和黃豆苷等異黃酮的合成。紫外光、藍光和白光對誘導大豆合成mRNA、提高PAL活性和合成異黃酮具有促進作用，其中紫外光的作用最強，但抑制大豆生長。

擬南芥細胞培養(yǎng)物在UV-B照射數(shù)小時后，刺激CHS基因的轉錄與表達，而藍光照射不明顯，紅光和遠紅光幾乎無反應[17]。

不同光質之間還存在互作效應。紅外光、藍光和遠紅外光處理歐芹細胞培養(yǎng)物均不產(chǎn)生黃酮，而紫外光處理10 min后即有效果。若在紫外光處理前后用紅外光、藍光、遠紅外光處理，均能增強紫外光的效果[18]。

2.1.2光量

在一定的光照范圍內，最適光照強度及時間可使異黃酮合成量最多。徐茂軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在0～60μmol/（m2·s）光照強度范圍內， 發(fā)芽大豆PAL活性和異黃酮含量隨著紫外光照射強度的增加而顯著提高；當紫外光照射強度超過60μmol/（m2·s）時，PAL活性和異黃酮含量上升幅度較小。隨著光質處理時間的延長，大豆芽苗菜的子葉中大豆異黃酮含量總體呈先上升后降低或持續(xù)降低的趨勢，而下胚軸中則相反[11]。

2.1.3光周期

異黃酮合成途徑中關鍵酶受光周期控制，從而影響光誘導異黃酮合成的效果。Harmer等[20]在對擬南芥中8 000個基因的表達量進行微陣列測定后發(fā)現(xiàn)，23個與苯丙素類成分生物合成相關基因的表達體現(xiàn)出晝夜節(jié)律性變化，大部分在黎明前表達量達到峰值，形成“酚類屏障”，以保護植物在白天免受光傷害。Kim等[21]以10 h光照、14 h黑暗處理后，再行連續(xù)光照的模式處理大豆葉片，發(fā)現(xiàn)IFS、CHI、F3H均表現(xiàn)出受晝夜規(guī)則調控的現(xiàn)象，這3種酶的mRNA含量隨之變化的現(xiàn)象很明顯：IFS的mRNA含量在光照下達到最大值，F(xiàn)3H的mRNA含量則在黑暗下達到最大值，可見兩者的表達量不是同時達到最大值的，這樣可以降低它們對底物柚皮素的競爭作用。由于CHI的mRNA含量變化周期很短，因而CHI的mRNA最大值并不明顯，但是其最小值不是出現(xiàn)在F3H或IFS最大值時。

2.2 NO誘導

NO是植物中一種新型的信號分子，來源于臭氧（O3）脅迫或硝普酸鈉（sodium nitroprusside，SNP），可調控黃酮等次生代謝產(chǎn)物合成過程。

2.2.1硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）途徑

在O3脅迫下，銀杏懸浮細胞中NO含量提高，NO淬滅劑對O3誘發(fā)銀杏細胞黃酮合成的抑制作用表明NO是O3誘發(fā)銀杏細胞中黃酮合成積累所必需的信號分子。O3處理可提高銀杏細胞NR活性，NR抑制劑鎢酸鹽（tungstate，TUN）和谷氨酰胺（glutamine，Gln）在抑制銀杏細胞中NR活性的同時還顯著抑制O3對銀杏細胞NO產(chǎn)生的誘導作用，表明O3可能依賴NR途徑誘導銀杏細胞產(chǎn)生NO[22]。

由SNP提供的NO激發(fā)懷槐細胞PAL活性，而PAL抑制劑氨氧乙酸有抑制NO激發(fā)異黃酮合成的作用，因而有理由認為在NO作用下，異黃酮為從頭合成。DNA甲基化水平檢測結果顯示，NO作用使得懷槐培養(yǎng)細胞DNA甲基化水平升高，且隨異黃酮的合成而呈動態(tài)變化。DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜胞苷可阻斷NO激發(fā)下異黃酮的合成。因此，NO激發(fā)懷槐培養(yǎng)細胞生成的異黃酮可能與DNA甲基化有關[23]。

2.2.2與cGMP共調控

白光照射下，所有受cGMP誘導的大豆異黃酮合成途徑中的基因也受SNP誘導。NO的激發(fā)效應能被其抑制劑6-苯氨基-5,8-喹嗪阻斷。Northern blotting分析表明，NO作為共同調控子，在轉錄水平上誘導編碼黃酮合成酶的基因表達。SNP處理能瞬間使cGMP水平提高4倍。大豆子葉中黃豆苷元和染料木黃酮對NO有響應，而對cGMP無響應，因而cGMP和NO在異黃酮合成過程中可能不是同時發(fā)揮作用的[24]。

2.3茉莉酮酸化合物處理

白羽扇豆種子在吸脹過程中，茉莉酮化合物能夠促進其子葉中異黃酮含量增加[25]。茉莉酮酸（jasmonate，JA）及茉莉酮酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是植物脂質衍生物，具有廣譜的生理效應，可調控許多基因的表達[26]。茉莉酮化合物能夠誘導植物防御細胞內信號轉導途徑，從而誘導植物次生代謝途徑中PAL、CHS等相關酶類合成[27]，改變植物細胞結構，以此響應異黃酮的合成。

2.3.1改變細胞結構

在MeJA作用下，懷槐細胞異黃酮合成量顯著提高，且細胞內染色很深的電子致密小體（electron-dense body，EDB）數(shù)量隨異黃酮含量的升高而增加，第9天達到峰值，且與異黃酮積累呈正相關，推測MeJA可能誘導植物細胞結構變化，以此響應異黃酮的合成[28]。

2.3.2促進關鍵酶基因表達

大豆黃化苗受傷后迅速積累的JA或外源添加的MeJA均能增加CHS和IFS基因表達量[13,21]。Creelman等[29]指出，在植物抗病方面，主要是依靠MeJA對次生代謝產(chǎn)物的調節(jié)作用，尤其體現(xiàn)在對CHS和PAL基因的調節(jié)上，MeJA處理可使兩者mRNA少量增加。

2.4稀土元素（rare earth element，REEs）處理

鑒于REEs對植物生長具有廣泛的促進作用，很多學者將REEs用于促進紫杉醇、黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物的合成。由于REEs很難在短時期內進入細胞內部，因而REEs可作為胞外信號起作用。

2.4.1改變細胞滲透性和結構

利用電子顯微鏡觀察到鈰離子在細胞壁和質膜上大量沉積，其中大部分被液泡包裹成晶體或無定形物，從而調節(jié)細胞質膜的滲透性，進而增強細胞對營養(yǎng)物質的吸收、利用和轉化，促進植物次生代謝物的合成[30]。REES還有改變細胞超微結構的作用，促進細胞分化[31]。

2.4.2改變氧化還原態(tài)

適量的稀土元素鑭（La）、鈰（Ce）在顯著提高還原型谷胱甘肽（reduced glutathion，GSH）、抗壞血酸（ascorbic acid，ASC）含量和GSH/氧化型谷胱甘肽（glutathionedisulfid，GSSG）、ASC/脫氫抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DHA）比率的同時，又明顯降低細胞中GSSG、DHA含量，從而改變細胞內氧化還原態(tài)，進而影響次生代謝途徑中PAL和IFS活性，最終調節(jié)異黃酮的合成[32]。

2.4.3改變酶結構

UV-B輻射脅迫下，植物中PAL、C4H、4CL和CHS活性提高，類黃酮含量升高，但在恢復期急劇下降，這是由于UV-B輻射導致酪氨酸（tyrosine，Tyr）和色氨酸（tryptophan，Trp）熒光同時被淬滅，CHS肽鏈上酰氨基吸收峰及Tyr和Trp等芳香氨基酸的殘基對紫外吸收峰值下降，從而改變分子空間結構，降低CHS活性。CHS蛋白表面存在大量負電荷集中區(qū)。La3+易與CHS蛋白相互作用，導致CHS蛋白結構發(fā)生改變。因而低劑量La3+與CHS肽鏈中的酰氨基團上O或N原子及CHS肽鏈上Tyr和Trp等芳香氨基酸殘基發(fā)生作用后，使CHS微結構變化，穩(wěn)定CHS結構，從而對活性中心產(chǎn)生微擾作用，進而影響CHS活性，促進類黃酮合成，降低UV-B輻射誘導的自由基產(chǎn)生[30]。

2.5基因工程技術

通過基因工程的手段可改變次生代謝流向或擴展乃至構建新的代謝途徑，以大量積累代謝產(chǎn)物。

2.5.1加速限速反應

Jung等[33]將含有編碼IFS基因片段的質粒轉導入來自大豆液體培養(yǎng)胚細胞中，使轉基因種子中異類黃酮含量增加。Jung等[34]將IFS基因轉入擬南芥中，使異黃酮合酶在其中表達，從而合成異黃酮，其中大豆苷元含量達到2 ng/mg。然而已有的研究表明，過量表達PAL、C4H、4CL、CHS、IFS和CHI等異黃酮合成途徑中單個關鍵酶，并不一定能使異黃酮含量顯著增加[35]。Sangeeta等[36]利用微陣列技術分析發(fā)現(xiàn)：CHS8基因是激活整個類苯基丙醇通路的關鍵基因，因而也是異黃酮累積的關鍵基因；CHS8基因的過量表達使得異黃酮支路代謝水平因主通路被激活而略有提高，異黃酮含量隨之呈略有增加。據(jù)此，易金鑫等[37]推測在主通路以外，異黃酮支路中可能還存在關鍵基因，兩者共同的過量表達使異黃酮含量顯著提高。研究證實CHS8是類苯基丙醇主路徑中的主基因，異黃酮支路中的IFS2基因在高異黃酮和低異黃酮品種中的表達差異亦達到顯著水平。利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉化系統(tǒng)在大豆上分別過量表達CHS8、IFS2和CHS8+IFS2，前兩者異黃酮含量較對照分別提高65.9%和34.4%，而后者提高82.3%，增幅達極顯著水平（P＜0.000 1）。由此證實大豆異黃酮積累由主通路中CHS8基因和支路中IFS2基因共同決定[37]。

2.5.2轉錄調控因子策略

將玉米C1和R轉錄因子轉入大豆中，苯丙烷通路PAL、C4H、CHI、CHR、F3H和二氫黃酮醇-4-還原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）基因被激活，染料木黃酮含量減少，黃豆苷含量增加，從而使總異黃酮含量增加。同時，抑制F3H表達基因的導入來抑制F3H與IFS競爭底物柚皮素，從而阻斷花青素等黃酮類物質合成。激活轉錄因子與抑制競爭性途徑的共同作用可促進大豆異黃酮積累[38]。

將擬南芥的轉錄因子GmMYB176轉染到大豆胚中分離的原生質體中，反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）監(jiān)控內源CHS8的轉錄。結果表明，GmMYB176在大豆胚原生質體中瞬時表達，使CHS8轉錄水平在48 h內增加169倍[39]。大豆毛狀根中GmMYB176基因沉默將導致異黃酮水平下降，表明GmMYB176對于異黃酮生物合成的必要性。但是過量表達GmMYB176并不能增加CHS8轉錄和異黃酮水平，這表明GmMYB176調控CHS8基因可能需要另外的輔助因子。亞細胞定位研究證實GmMYB176定位于核中，但其本身不具有核定位信號[39]。大豆基因組包含18個14-3-3蛋白，其中16個已被成功轉錄[40]。14-3-3蛋白中某一位點的缺失會改變GmMYB176的亞細胞定位[41]。雙分子熒光互補和酵母雙雜交實驗也表明，GmMYB176與14-3-3蛋白互作[42]，因而GmMYB176的核定位可能需要14-3-3蛋白與其pST的位點結合，從而促進CHS8基因的表達，提高異黃酮含量[43]。

2.5.3改變代謝途徑流向

應用反義技術和RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術可減少或阻塞非目標代謝物的合成，從而改變植物分叉代謝途徑流向，為目標產(chǎn)物合成提供更加充足的合成前體。

RNAi技術已被廣泛用于調控植物中苯丙烷類次生代謝產(chǎn)物的合成。Jiang Yina等[44]根據(jù)RNAi技術原理構建的雙價RNA干擾植物表達載體使大豆中F3H和GmFNSII基因沉默，并分別構建了兩基因的單價RNA干擾植物表達載體。通過發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC 15834對大豆子葉轉化，驗證所構建RNA干擾植物表達載體的效率。高效液相色譜分析結果顯示，與兩個單價RNAi載體相比，RNAi載體轉化生成的毛狀根中雙價RNAi載體更有利于總異黃酮的合成，根中轉化總異黃酮的量是對照組的2倍。

3 結 語

目前已初步探明植物性食品原料中異黃酮形成機理及影響其富集的因素。在諸多調控技術中，紫外光誘導作用及其機理的研究較為深入。但紫外光在促進異黃酮積累的同時也會傷害植物。有必要將光誘導技術與添加外源NO、稀土元素、激素或外源生長調節(jié)劑及施肥等技術結合使用，以平衡異黃酮積累和植物生長，進一步促進異黃酮積累。例如，將紫外光誘導與SNP處理聯(lián)用，充分發(fā)揮內源和外源NO在促進異黃酮積累和植物生長方面的調控作用。對于應用代謝工程技術生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物方面，可考慮尋找更為有效的轉錄因子，并明確其調控異黃酮合成的關鍵酶的輔助因子，深入探討蛋白質間互作在其中的作用，達到富集異黃酮的目的。植物性食品原料用生物技術富集異黃酮后，可作為制造功能性食品的原料，這必將具有廣闊的市場前景。

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Formation Mechanism and Factors Influencing Accumulation of Isoflavones in Edible Plants

JIAO Caifeng, YANG Runqiang, GU Zhenxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Isoflavones, as phenolic components, are the secondary metabolites found mostly in legumes with many healthpromoting functions on humans. The latest research on the formation mechanism of isoflavones and accumulation techniques based on environmental induction and genetic modification in edible plants is summarized in this paper.

isoflavones; formation mechanism; accumulation; influencing factors

TS202.1

1002-6630（2015）11-0256-05

10.7506/spkx1002-6630-201511048

2014-08-11

江蘇省科技支撐計劃（農(nóng)業(yè)）項目（BE2013430）

焦彩鳳（1990—），女，博士研究生，研究方向為活性物質富集機理與技術。E-mail：291454291@qq.com

*通信作者：顧振新（1956—），男，教授，博士，研究方向為活性物質富集機理與技術。E-mail：guzx@njau.edu.cn