菌落總數測試片研究進展

白 陽（國家知識產權局專利局專利審查協作廣東中心，廣東 廣州 510530）

菌落總數測試片研究進展

白 陽
（國家知識產權局專利局專利審查協作廣東中心，廣東 廣州 510530）

菌落總數作為判定食品被污染程度的標志，具有重要的衛生學意義。菌落總數測試片具有攜帶方便、不用配制培養基的優點，是一種新型的檢測工具。近年來專家學者圍繞菌落總數測試片進行了相關研究。對這些研究進行分析和綜合，具有一定的理論價值和現實指導意義。

菌落總數；測試片；研究進展

食品是人類賴以生存和發展的物質基礎，而食品安全關系到人們的健康和國計民生，已經越來越受重視。隨著社會的進步，人們的生活水平不斷提高，有關部門加大了食品安全方面的執法力度，其中菌落總數是食品衛生檢驗中最基本、最常見的微生物指標檢測項目。國際微生物規格委員會將菌落總數定義為在被檢樣品的單位重量（g）、容積（mL）或表面積（cm2）內，所含能于某種固體培養基上，在一定條件下培養后所生成的菌落的總數。菌落總數是判定食品被細菌污染程度的重要標志，能反映食品加工及儲藏過程是否符合食品衛生要求。通常認為，食品中細菌數量越多，致病菌污染的可能性越大。菌落總數還可用于觀察食品中微生物的性質以及微生物在食品中繁殖的動態，以便在對被檢樣品進行衛生學評價時提供科學依據。近年來，隨著環境污染的加劇和生態平衡的破壞，人類感染的致病菌的種類越來越多，病原微生物對人類的威脅越來越大，因此，采用適當的檢驗方法對食品菌落總數進行檢測，是預防食源性中毒的重要手段。

1 食品中常見的微生物

引起食品污染的微生物種類繁多。有的是在食品加工過程中被外界污染的細菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等；有的是新鮮食品上正常的菌群在加工過程中殘留下來的微生物，如乳酸菌等；有的是食品工業上重要的發酵菌，如酵母菌等。某些殘留的細菌不僅可能引起食品腐敗變質，還可能引起疾病。目前食品中常見的微生物有19個種屬，具體見表1。

表1 食品中常見的微生物菌屬

續表1

2 菌落總數傳統檢驗方法

目前國內食品中的菌落測定主要是按GB／T 4789.2—2010《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》標準進行，采用平板計數法。根據樣品的實際污染情況，對樣品進行 10倍遞增稀釋，選擇 2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，吸取 1 mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿；將融化并冷至 45～50℃的平板計數瓊脂培養基傾注到各平皿內，每皿15～20 mL，隨即轉動平皿，使樣品與培養基充分混勻，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置于36±1℃培養箱內培養 48±2 h；另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入 15～20 mL平板計數瓊脂培養基，待瓊脂凝固后，翻轉平皿，置于36±1℃培養箱內培養 48±2 h，作為空白對照；按照 GB／T 4789.2—2010《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》標準進行結果判定。一般來說，傳統培養基成本較低，但采用傳統方法進行菌落總數測定存在明顯不足［1］：一是培養基制備、儀器清洗、滅菌都需要較多的時間和人力，費時費力；二是由于傳統方法一般需要較長時間，且需要特定的溫度，對實驗室儀器及無菌條件要求較高，不適合野外操作；三是傳統培養方法中如果培養基的溫度過高，容易使待測樣品中的微生物因不適宜而受損，從而影響測定結果的準確性。

3 菌落總數測試片

隨著檢測技術的不斷發展，先進的檢測方法不斷出現。目前美國 3M公司的菌落總數測試片法在世界各地使用得比較多。菌落總數測試片是指以滅菌濾紙、無紡布或冷水可溶凝膠等吸收培養基作為載體，將特定的培養基和顯色物質附著在載體上面，通過微生物在其上面的生長、顯色情況來測定食品中微生物的一種產品。菌落總數測試片的顯著優點［2］：第一，可測定少量檢品，不需要配制試劑和大量的玻璃器皿，操作簡便，經濟，實用；易于消毒保存，攜帶方便，價格低廉，能大大減少或消除對環境的污染，能減少試驗后的清洗工作，能克服熱瓊脂法不適宜受損細菌恢復的缺陷，故適用于實驗室、生產現場和野外工作環境。第二，可以在取樣的同時接種，結果更能真實地反映當時樣本中的細菌數，防止由于細菌繁殖造成的數量增多。第三，不用進行使用前的準備工作，能大大節省時間、人力和物力。

3.1 菌落總數測試片研究進展

3.1.1 菌落總數測試片載體

目前，濾紙、無紡布和冷水可溶性凝膠是 3種最常見的載體［3］。

濾紙。由于濾紙具有較大的間隙，用濾紙作載體，濾紙雙面和纖維之間容易有菌落生長，使肉眼無法準確判斷，所以測定結果一般比實際菌數要少；濾紙保水性差，檢驗培養時又不能保持充分濕度，不利于菌體生長；濾紙檢驗卡存在營養物質分布不均勻的問題，加樣也不能迅速擴散，致使菌體生長分布不均勻；由于顯色指示劑系統單一，不能有區別地對細菌進行計數，對真菌更差，所以很難全面推廣。

無紡布。無紡布是以紡織纖維為原料，經過黏合、熔合或其他化學、機械方法加工而成的紡織品。無紡布有薄型和厚型兩大類，可用以制成有透氣、防毒和加速擴散等特殊用途的材料。德國拜發公司的RIDA?COUNT微生物菌落計數板和日本 CHISSO公司的SANITA-KUN微生物快速檢測片，都是以無紡布為載體的新型檢測片。無紡布加樣后能迅速擴散，菌體生長分布均勻；但無紡布和濾紙型菌落總數測試片都不能挑菌作進一步實驗，因而影響其應用前景。

冷水可溶性凝膠。冷水可溶性凝膠結構穩定、透明、回收率高，且可進行挑菌，方便對微生物做進一步鑒定，使得此類測試片的綜合評價較高，具有廣闊的應用前景。冷水可溶性凝膠劑一般不是微生物的營養成分，只起固化或黏合作用。3M公司的菌落總數測試片就是以冷水可溶性凝膠為載體的。理想的凝膠劑應具備以下條件：不會被微生物分解利用，不會因高溫滅菌而受到破壞，在微生物生長的溫度范圍內保持固體狀態，對微生物及操作人員均無毒害作用，透明度好、凝固力強、價格低廉、配制方便。常見的凝膠劑有瓊脂、羧甲基纖維素鈉、明膠、丙烯酸鈉等［4］。目前關于測試片中凝膠劑的報道較少：國外，僅在美國的專利中報道過瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、聚丙烯酸系高分子化合物等，但報道得并不明確，也不系統；國內，廣東環凱微生物測試科技有限公司研制的聚丙烯酸鈉可以作為菌落總數測試片的凝膠劑。

3.1.2 菌落總數測試片顯色培養基

一般的顯色培養基由營養物質、誘導劑和顯色劑組成。目前有關菌落總數顯色劑的報道比較單一，主要集中在氯化三苯四氮唑（TTC）和噻唑藍（MTT）上。TTC是目前最常用的顯色劑，并已成功應用到菌落總數測試片上。TTC是一種氧化劑，細菌細胞內具有脫氫酶，在細菌脫氫酶的作用下，TTC接受氫（H）成為紅色而穩定的三苯甲臜，使菌落呈現紅色，在細菌培養中，細菌在一定濃度TTC的培養基中生長而形成的菌落呈現紅色。在菌落總數測試片中形成紅色點狀物，出現在測試片之上，紅點的總數就是細菌的總數，這樣計數更加準確。據報道，TTC濃度過高會對細菌的生長產生抑制作用，所以菌落總數測試片中 TTC的濃度要以能靈敏顯示細菌生長情況且對細菌無副作用為宜。當培養基中的TTC濃度為0.005% ～0.01%時，基本無抑菌現象。誘導劑的添加情況對菌落總數測試片的快速檢測結果有重要影響。菌落總數測試片講究快速，由于一部分細菌在24 h后才逐漸顯現，所以在顯色培養基中加入一些誘導物質以促進細菌快速生長顯得尤為重要。常見的誘導劑有血消化液、胱氨酸、肝心浸液等。1999年有報道顯示，在培養基中加入生長促進因子血消化液，可使這部分細菌在16 h后就能生長出來，而不加促進因子的培養基在 24 h后才開始生長。2004年有報道顯示，胱氨酸等物質不僅具有增菌作用，還能增強顯色劑的色度。營養物質方面除了要保證各類細菌生長所需的營養外，還應充分考慮顯色培養基緩沖體系，可以添加氯化鈉和磷酸二氫鉀等緩沖劑，以保證細菌平衡，不受損傷。

3.2 菌落總數測試片產品

目前比較成熟的菌落總數測試片產品主要有美國3M公司的PetrifilmTM細菌總數測試片和德國拜發公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數板。廣東環凱微生物科技有限公司也致力于菌落總數測試片的研究，并取得實質性進展。

3.2.1 美國3M公司的PetrifilmTM細菌總數測試片

美國3M公司發明的用于菌落計數的可再生水合物干膜（PetrifilmTMAerobie Count Plates）目前處于世界領先地位。它由上下兩層薄膜組成，下層的聚乙烯薄膜上印有網格且覆蓋有培養基，上層是聚丙烯薄膜。培養基中含有微生物生長及生化實驗所需的營養及試劑，并通過一種冷水可溶性凝膠劑附著在上下兩層膜上。常用的凝膠劑為果阿膠，另外還有黃原膠、洋豆膠等。生化試劑有特異性顯色物質和抗生素。待測樣品處理后不需要增菌，直接接種測試片，適宜溫度培養后計數。測試片的外觀呈長方形，未開封的鋁箔袋冷藏于8℃的冰箱中，已開封的鋁箔袋應用膠帶將封口封緊，置于常溫干燥處。

3M公司的PetrifilmTM測試片已通過國際組織AFNOR、FDA和AOAC的認可。使用方法：揭起覆蓋的膠片，將 1 mL樣品懸液滴于測試片中央后蓋回，用壓板輕輕壓下，將樣品均勻地覆蓋于培養基上，靜置約1 min，使培養基中的凝膠固化；將測試片水平放于37℃恒溫箱內培養，細菌總數測試片培養48±3 h后所計的紅色菌落數即為細菌總數。

近年來，美國3M公司對測試片做了很大的改進，在樣品接種后48 h可準確報告結果。盧行安等對所選定的8類未加工和已加工食品進行菌落總數測定，利用3M公司的 PetrifilmTM菌落總數測試片測試，結果與采用 GB／T 4789.2—2010標準測定所得無統計學差異［5］。Heddeghen等用美國 3M公司測試片對鮮奶進行檢測，其重復性較好。唐漪炎報道，采用3M公司的 PertifilmTM細菌總數測定紙片對消毒奶、酸奶、乳酸飲品、黃油、冰激凌、脫脂奶粉、奶酪、布丁、生奶等十余種產品進行檢測，48±3 h報告結果，經統計對比，兩種方法無顯著差別，細菌總數測定紙片法檢出率比國標法高。

雖然3M公司的PetrifilmTM測試片具有快速、方便、靈敏度高、特異性強等特點，但仍存在一些不足：價格昂貴，目前尚不適合在食品生產企業及基層單位全面推廣；PetrifilmTM測試片上覆蓋一層薄膜，當細菌產氣、產黏液過多時會出現菌落的擴散，影響計數；計數方面，PetrifilmTM測試片面積較小，當菌量大于 250 cfu時，準確計數較困難；待測樣品中含有的某些有機物可能會使顯色減緩，從而降低目測效果，導致計數偏低；培養基吸水較慢，如果在未均勻分布前用力擠壓，會使稀釋液體從邊緣流出，影響結果；PetrifilmTM載體底板不透明，光源不能透射，不能用自動計數儀計數，需更多人力物力。

3.2.2 德國拜發公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數板

德國拜發公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數板選用的載體為硝酸纖維素型無紡布，它是一種將脫水培養基附著于無紡布棉墊上的即用型檢測產品，由上下兩部分組成，上層為透明覆蓋膜，下層自上而下為無紡布層、底層涂有黏性物料的薄片和包含了培養基的水溶性復合膜。當樣品液滴加在無紡布上時，會立刻擴散并溶解于復合膜內，形成高黏性的溶液，經培養后形成菌落。

德國拜發公司的 RIDA?COUNT微生物菌落計數板已經獲得國際組織 AOAC的認可。使用方法：揭開覆蓋膜，將1 mL樣品懸液緩緩且均勻地滴于無紡布上，靜置5 s，待樣液完全吸收后，緩緩地將覆蓋膜蓋回，注意不要壓蓋無紡布部分，可沿薄膜邊緣壓緊；將接種后的測試片水平放于37℃恒溫箱內培養，細菌總數測試片培養 48±2 h后所計紅色菌落數即為細菌總數。這種微生物菌落計數板的不足是：不能兩面數菌，易遺漏，影響計數；加樣液后容易出現褶皺；不能挑菌作進一步實驗。

4 結語

目前，食品安全問題已受到全社會的關注。食品安全檢測產業迅猛發展，菌落總數的傳統檢測方法能較好地對菌落總數進行檢測。在GB／T 4789.2—2008和 SN／T 1987—2007標準中，菌落總數測試片法是菌落總數測定的方法之一。可以預見，菌落總數測試片法將逐步成為傳統檢測手段的重要補充，甚至可能逐步成為主流的檢測方法。菌落總數測試片具有良好的市場發展前景，但到目前為止，還未見過由我國自主研發的具有高靈敏度和高準確性的菌落總數測試片產品的相關報道，對菌落總數的檢測仍主要采用傳統的方法或購買較昂貴的國外產品，這對我國食品檢測技術的發展造成了一定的阻障。因此，研發具有我國自主知識產權、具有高靈敏度和高特異性的菌落總數測定產品成為一項重要且緊迫的任務。

［1］吳毓薇，吳許文，吳清平，等.食品衛生微生物測試片檢測技術進展［J］.中國衛生檢驗雜志，2008，（12）：2832－2834.

［2］李鐵牛.紙片法檢測飲料中菌落總數的研究［D］.重慶：西南農業大學，2004.

［3］孫永.食品衛生微生物快速測試卡的研制［D］.北京：中國科學院研究生院，2007.

［4］呂嘉櫪，韓迪.MTT和 TTC在嗜酸乳桿菌菌落計數中的應用［J］.中國乳品工業，2007，（4）：23－25.

［5］盧行安，顧其芳，袁寶君，等.AOAC PetrifilmTM菌落總數測試片法與食品中菌落總數測定國標方法的比較研究［J］.中國食品學報，2011，（3）：164－167.

［責任編輯：羅 香］

Research Progress in Test Piece of Aerobic Bacterial Count

BAI Yang
（Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office，SIPO，Guangzhou 510530，Guangdong，China）

As a target for the extent of contamination in food，aerobic bacterial count is very important in sanitization，and it is a new kind of detection tool which is convenient to carry and free of media preparation.In recent years，experts and scholars have carried out some investigations on aerobic count.The comprehensive analysis for these studies has certain theoretical value and practical guiding significance.

aerobic bacterial count；test piece；research progress

TS201.6

：A

：1006－8481（2015）02－0001－04

2014－11－02

白陽（1987—），男，國家知識產權局專利局專利審查協作廣東中心，碩士。