響應面法優化纖維素酶輔助提取黃芪總皂苷的工藝研究

呂鳳嬌，謝曉蘭

(泉州師范學院化學與生命科學學院，福建泉州 362000)

0 引言

纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱［1－2］．大部分中藥材的細胞壁是由纖維素構成，而中藥的有效成分往往被包裹在細胞壁內．要提高中藥有效成分的提取，就需要通過纖維素酶的降解作用來破壞植物細胞壁，使得有效成分能更好地從細胞內流出，從而提高有效成分的提取率［3－6］．

響應面分析法通過中心組合試驗，采用多元線性回歸方法進行函數估計，將多因素實驗中影響因素與水平的相互關系用多項式進行擬合，通過對方程求極值的方法達到參數優化的目的［7－10］．響應面法克服了正交試驗只能對一個個孤立的試驗點進行分析和不能給出直觀圖形的缺陷，因此響應面法被稱為是尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法［11］，已經越來越多地應用于各種生物化工處理過程的優化［12－14］．將纖維素酶用于黃芪中總皂苷的提取，并應用響應面分析法優化pH值、酶解時間、酶解溫度及酶用量對黃芪總皂苷提取率的影響，從中優選出黃芪總皂苷的最佳提取工藝條件．

1 實驗部分

1．1 儀器與試劑

UV752紫外可見分光光度計(上海佑科儀表有限公司);KQ2200DA型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);HH－4數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);SENCO旋轉蒸發器(上海申生科技有限公司);SHB－Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);DZF－6051型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);BS224S電子天平(北京賽多利斯儀器系統公司)．黃芪甲苷對照品(武漢祥和精細化工有限公司);纖維素酶R－10(上海金穗生物科技有限公司);黃芪飲片(購自晉江寶龍大藥房);其他試劑均為分析純．

1．2 實驗方法

1．2．1 纖維素酶提取法

取一定量的黃芪飲片置于粉碎機中進行粉碎，10 min后取出，過0．3 mm篩，保存于密封袋中備用．精確稱取1 g黃芪粉末，加入70%(體積分數)乙醇溶液20 mL混合均勻，置于超聲波清洗器處理40 min;取出后調pH值，加入一定量的纖維素酶，置恒溫水浴鍋反應．反應結束后，于電爐上加熱5 min滅酶，趁熱過濾，將濾液在55℃水浴下旋轉濃縮至無醇味．殘渣用水溶解，用10 mL正丁醇萃取兩次，取正丁醇液濃縮，回收正丁醇，旋轉濃縮至干，用甲醇溶解，定容于25 mL容量瓶中，備用．

1．2．2 標準曲線的繪制

精確稱取黃芪甲苷對照品5．0 mg置于燒杯中，用甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶，加甲醇至刻度，定容即得黃芪甲苷的標準溶液(0．5 mg·mL－1)．精確吸取0．00、0．10、0．20、0．30、0．40、0．50 mL 注入編號為1～6號的具塞試管中，各加入甲醇補足至0．5 mL，再分別加入8%(質量分數)的香草醛無水乙醇試液0．5 mL，搖勻，置水浴中加入72%(體積分數)硫酸5．0 mL搖勻，立即放入62℃恒溫水浴中，保溫20 min，迅速取出置冷水浴中10 min．在30 min內，以1號試管中的待測液作為空白參比，利用紫外可見分光光度計在波長540 nm處測定吸光度值．采用最小二乘法對結果進行線性回歸，得黃芪甲苷溶液濃度ρ(mg·mL－1)與吸光度值 A 關系的回歸方程式:A=1．958ρ－0．071 6(R2=0．993 1)．

1．2．3 黃芪總皂苷含量測定

精確吸取1．2．1備用溶液0．2 mL，置于具塞試管中，加甲醇補足至0．5 mL，加入8%(質量分數)的香草醛無水乙醇溶液5 mL，搖勻，置水浴中加入體積分數為72%(體積分數)的硫酸5．0 mL搖勻，立即放入62℃恒溫水浴中，保溫20 min，迅速取出置冷水浴中10 min，在30 min內于波長540 nm處測定其吸光度，代入回歸方程(1)計算其含量．

式中:ρ皂苷表示由標準曲線得到的待測液的濃度(mg·mL－1);0．5表示待測液的體積(mL);25/0．2表示從供試液到待測液稀釋的倍數;m表示所稱取的黃芪粉末的質量(g)．

2 結果與分析

2．1 單因素試驗結果與分析

采用單因素法對pH值、酶解時間、酶解溫度和酶用量對黃芪總皂苷提取率的影響先進行考察，結果如圖1～圖4所示．由圖1知，pH值為4．5時黃芪總皂苷的提取率為最大值，故pH值控制在4．5左右．由圖2知，隨著纖維素酶酶解時間的延長，黃芪總皂苷的提取率也在不斷的增加，纖維素酶酶解120 min以后總皂苷提取率趨于穩定，從提高效率考慮選擇120 min為最佳酶解時間．

圖1 pH值對黃芪總皂苷提取率的影響Fig．1 Effect of pH on the yield of Astragalosides

圖2 酶解時間對黃芪總皂苷提取率的影響Fig．2 Effect of the enzyme reaction time on the yield of Astragalosides

如圖3所示，隨著酶解溫度的升高，提取率也相應升高，但當溫度超過45℃后，提取率的變化趨勢逐漸平緩，當超過50℃后，則呈現出下降的趨勢．這是因為纖維素酶是一種蛋白質，當溫度在50℃以上時，隨著溫度的升高，蛋白質開始變性，酶活性下降，因此總皂苷的提取率降低．實驗將酶解的最佳溫度控制在50℃左右．如圖4所示，隨著酶用量的增加，總皂苷的提取率也隨之增加，但當酶用量超過8 mg后，提取率并沒有很大程度的增加．可能是因為此時黃芪中的纖維素、果膠等已接近完全分解，再增加酶用量只會增加提取過程中的耗材成本，所以實驗中選取纖維素酶的用量控制在8 mg左右．

圖3 酶解溫度對黃芪總皂苷提取率的影響Fig．3 Effect of the temperature on the yield of Astragalosides

圖4 酶用量對黃芪總皂苷提取率的影響Fig．4 Effect of the cellulase dose on the yield of Astragalosides

2．2 響應面試驗結果與分析

2．2．1 Box －Behnken 實驗設計

綜合考慮單因素試驗結果，根據Box－Behnken的中心組合設計原理［15－17］，采用響應面法尋找纖維素酶輔助提取黃芪總皂苷的最佳提取條件．選取pH值、酶解時間、酶解溫度、酶用量4因素設計響應面試驗，因素與水平見表1．試驗設計方案及結果見表2．

表1 響應面因素與水平Tab．1 Variables and their coded levels used in response surface analysis

表2 Box－Behnken設計方案及響應值結果Tab．2 Box －Behnken experimental design and corresponding results

2．2．2 模型的建立和顯著性分析

對中心組合實驗的結果在Design Expert 8．0軟件中進行方差分析．結果顯示，模型P=0．000 1，表明模型極顯著影響．對因素的交互效應分析表明，一次項B、二次項A2、B2、C2都表現出極顯著影響，一次項D表現出高度顯著影響，二次項D2表現顯著影響，且失擬項P=0．224 7＞0．05，失擬不顯著，表明該回歸模型合適．

對表2中的試驗數據進行統計分析，可得到預測響應值與自變量的二次回歸方程為:Y=1．85－0．023A+0．086B+0．020C+0．048D+0．007 5AB+0．035AC －0．023AD+0．023BC+0．028BD+0．012CD －0．091A2－0．16 B2－0．15C2－0．040D2．

為簡化二次回歸方程，剔除偏回歸系數不顯著的AB、CD項，建立如下二次回歸方程:Y=1．85－0．023A+0．086B+0．020C+0．048D+0．035AC － 0．023AD+0．023BC+0．028BD － 0．091A2－ 0．15B2－0．11C2－0．040D2．由方差分析(表3、4)得出，剔除不顯著項后，該模型的 F值由11．857 74變為15．338 4，表明經簡化后，該模型更顯著，且失擬項不顯著，模型預測值和實際值擬合較好．由P值可知，對總皂苷提取率影響的大小依次為B(酶解時間)＞D(酶用量)＞A(pH值)＞C(酶解溫度)．回歸方程的相關系數R2為0．920 0，由此可知，pH值、酶解時間、酶解溫度、酶用量對總皂苷提取率的影響不是簡單的線性關系．變異系數為2．60%，說明該模型的精密度較好，實驗操作可信．

表3 二次回歸方程方差分析Tab．3 Variance analysis for the regression model

表4 簡化后的二次回歸方程方差分析Tab．4 Variance analysis for the simplified regression model

2．2．3 響應面分析

根據二次回歸方程繪出響應面圖均為開口向下的凸形曲面(圖5)，在考察范圍內存在響應值(黃芪總皂苷提取率)的極大值．等高線的形狀則反映交互作用的強弱．當等高線接近圓形時，兩因素的交互作用弱;當等高線呈現橢圓形時，兩因素的交互作用強．從圖5可以看出，只有pH值和酶解溫度可以反映出一定的交互作用，pH值和酶用量、酶解溫度和酶解時間、酶解溫度和酶用量未表現出交互作用，這與簡化后的方差分析(表4)結果一致．

圖5 各因素交互影響黃芪總皂苷提取率的響應面Fig．5 Response surface showed the interactive effects of different factors on the yield of Astragalosides

2．2．4 最佳條件的確定和模型驗證

由圖5所示的三維響應面圖可知擬合面存在真實的最大值，為了進一步確定黃芪總皂苷提取率的穩定點，對回歸方程進行一階偏導并使其等于零，整理得如下方程組:

解方程組得模型的極值點為:A= －0．247，B=0．400，C=0．129，D=0．839;代入回歸方程，解得預測的黃芪總皂苷提取率為1．89%，此時pH值為4．38，酶解時間為132．01 min，酶解溫度為51．29℃，酶用量為8．84 mg．考慮到實際操作的便利，取酶解時間為132 min，酶解溫度為51℃．采用響應面實驗得到的最佳條件進行實驗，重復三次，黃芪總皂苷實際提取率為(1．87±0．03)%．回歸方程預測值與實際值吻合良好．

3 結語

實驗采用響應面法對纖維素酶輔助提取黃芪總皂苷工藝進行優化．建立響應值與自變量間的二次回歸模型方程，通過剔除偏回歸系數不顯著的AB、CD項，得到簡化的二次回歸方程:Y=1．85－0．023A+0．086B+0．020C+0．048D+0．035AC － 0．023AD+0．023BC+0．028BD － 0．091A2－ 0．15B2－ 0．11C2－0．040D2．模型極顯著影響，且失擬項不顯著，回歸模型合適．得到黃芪總皂苷提取的最佳條件:pH值為4．38，酶解時間132 min，酶解溫度51℃，酶用量8．84 mg，預測提取率1．89%，實際提取率(1．87±0．03)%．回歸方程預測值與實際值吻合良好，據此可認為實驗數據可靠，依據模型數據可有效指導實驗．

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