IL-12B基因多態性及血清表達水平與食管癌的關系

彭麗娟 杜經緯 徐 俊 常晉霞 胡為民 潘萬龍.川北醫學院微生物學與免疫學教研室，四川南充67000；.四川省南充市中心醫院耳鼻咽喉科，四川南充67000；.四川省南充市中心醫院心胸外科，四川南充67000

IL-12B基因多態性及血清表達水平與食管癌的關系

彭麗娟1杜經緯2徐 俊3常晉霞1胡為民1潘萬龍1
1.川北醫學院微生物學與免疫學教研室，四川南充637000；2.四川省南充市中心醫院耳鼻咽喉科，四川南充637000；3.四川省南充市中心醫院心胸外科，四川南充637000

目的探討白細胞介素（IL）-12B 3′UTR+16974（A/C）位點單核苷酸多態性（SNP）及其血清表達水平與食管癌的關系。方法隨機選取2013年6月～2014年6月在四川省南充市中心醫院就診的食管癌患者52例為試驗組，術后收取患者腫瘤組織和癌旁組織，提取其基因組DNA，針對IL-12B基因3′UTR+16974（A/C）SNP位點進行PCR，擴增產物測序，其中患者腫瘤組織DNA作為癌組織，癌旁3～5 cm組織DNA作為癌旁組織，分析IL-12B基因多態性與腫瘤發生的關系。選取同期健康體檢者40例為對照組，同時收集患者和健康體檢者血清，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測IL-12 p40和IL-12血清表達水平。結果癌組織AA、AC、CC基因型頻率分別是23.08%、15.38%、61.54%，癌旁組織AA、AC、CC基因型頻率分別是15.38%、38.46%、46.15%，差異有統計學意義（P＜0.05）。癌組織A、C等位基因頻率分別為30.77%（32/104）、69.23%（72/104），癌旁組織A、C等位基因頻率分別為34.62%（36/104）、65.38%（68/104），差異無統計學意義（P＞0.05）。試驗組IL-12 p40和IL-12血清表達水平均明顯高于對照組（P＜0.01）。結論IL-12B 3′UTR+16974（A/C）位點CC基因型可能是食管癌的易感基因型，IL-12 p40和IL-12血清表達水平升高與食管癌發生有關。

食管癌曰白細胞介素-12曰白細胞介素-12B曰多態性曰單核苷酸

白細胞介素（interleukin，IL）-12B是一種70 kD的糖蛋白，由相對分子質量為35（p35）和40（p40）（分別由IL-12A基因和IL-12B基因編碼）的兩條多肽鏈組成的異二聚體。IL-12B基因16974 A/C在羧基端非翻譯區具有多態現象，影響IL-12的產生與表達，并與Th1介導的疾病有關，如硅沉著病［1］、Graves眼病［2］、宮頸癌［3］等。研究發現，胃癌患者IL-12血清表達水平與疾病的嚴重程度有關［4］。本研究擬探討IL-12B基因多態性及血清表達水平與食管癌的關系，為尋找食管癌新的遺傳標記、食管癌診斷提供新依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年6月～2014年6月在四川省南充市中心醫院（以下簡稱“我院”）就診的食管癌患者52例為試驗組，其中男36例，女16例，平均年齡（63.81± 9.07）歲，均適宜做手術，術前均未接受放、化療，術后均經病理組織學確診為鱗狀細胞癌，無其他腫瘤病史。根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）第七版公布的食管癌分期為標準對患者進行分期。同時選取我院同期健康體檢者40例為對照組，其中男25例，女15例，平均年齡（45.35±8.72）歲，血常規、肝腎功、甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原（CA）242、CA125指標顯示無明顯異常。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及引物合成腫瘤組織DNA作為癌組織，癌旁組織DNA作為癌旁組織。分別收集患者術后新鮮腫瘤組織和癌旁3～5 cm組織10～20 mg，采用組織基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）快速提取DNA，-20℃保存。根據文獻設計包含IL-12B 3′UTR+16974 A/C位點SNP上游引物5′-GATATCTTTGCTGTATTTGTATAGTT-3′，下游引物5′-AATATTTAAATAGCATGAAGGC-3′，由武漢華大基因科技有限公司合成。

1.2.2 PCR反應及測序PCR擴增體系為25 μL，DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，dNTP 2 μL，10×緩沖液2.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，無菌去離子水18.3 μL。PCR反應程序為94℃預變性5 min，94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環。TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司，PCR反應在BIO-RAD PTC-200 PCR儀上完成。2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，產物送武漢華大基因科技有限公司測序。

1.2.3 ELISA檢測患者術前血清作為試驗組，健康體檢者血清作為對照組。收集相應患者術前和健康體檢者靜脈血液標本入凝血管，每人空腹抽血3 mL，室溫靜置凝血1～2 h，離心取血清-80℃保存。參照ELISA檢測試劑盒（上海藍基生物科技有限公司）說明進行操作，繪制標準曲線，計算出IL-12 p40和IL-12血清表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（依s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

提取的組織基因組DNA經PCR，擴增出包含IL-12B 3′UTR+16974位點基因片段，約1024 bp。擴增產物送武漢華大基因科技有限公司測序，經BLAST比對，結果與人IL-12B基因序列有99%的同一性。

2.1 IL-12B 3′UTR+16974淵A/C冤位點多態性3種基因型頻率分布

根據測序結果，癌組織和癌旁組織3種基因型頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；將3種基因型分別進行比較，AA和AC基因型構成比、AC和CC基因型構成比差異有統計學意義（P＜0.05）；CC基因型在癌組織中頻率明顯較癌旁組織高。見表1。

表1 IL-12B 3′UTR+16974（A/C）位點多態性3種基因型頻率分布［%（n1/n2）］

2.2 IL-12B 3′UTR+16974淵A/C冤位點多態性等位基因頻率分布

癌組織A等位基因和C等位基因頻率分別為30.77%（32/104）、69.23%（72/104），癌旁組織A等位基因和C等位基因頻率分別為34.62%（36/104）、65.38%（68/104），差異無統計學意義（χ2=0.35，P=0.55）。

2.3 兩組IL-12 p40和IL-12血清表達水平比較

試驗組IL-12 p40和IL-12血清表達水平均明顯高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；試驗組IL-12 p40和IL-12血清表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

3 討論

IL-12主要通過Th1細胞間接發揮抗感染、抗腫瘤作用［5-6］。在某些疾病中可見IL-12 p40異常表達，如IL-12 p40在經典型霍奇金淋巴瘤組織中的表達量均明顯高于彌漫性大B細胞淋巴瘤組織及反應性淋巴組織增生中的表達［7］。

圖1 兩組IL-12 p40和IL-12血清表達水平比較

近年發現某些疾病發生與IL-12B多態性有關。如IL-12B rs3212227基因多態性與卵巢癌的患病風險有關［8］；正常孕婦IL-12B基因啟動子區存在多態性變異，其中-671G/T和-405G/T構成的單體型-671T/-405G可能與原因不明復發性流產的易感性有關［9］；IL-12B rs3212227基因多態性與廣西地區人群原發性肝細胞肝癌有明顯關聯性［10］；IL-12B rs15677380和rs14050311基因多態性與肝硬化的發生存在關聯［11］；IL-12B rs3212227多態性與原發性肝細胞肝癌發病風險的關系不密切［12］。

食管癌多態性方面僅有個別基因位點多態性的報道，如ERCC1基因C8092A位點在福建地區食管鱗狀細胞癌患者中未見多態性表達［13］，食管癌患者血管緊張素轉換酶基因多態性和ATM基因rs664143位點多態性與食管癌的發生有一定聯系［14-15］。本研究通過直接對腫瘤組織DNA檢測，發現IL-12B 3′UTR+16974位點CC基因型在食管癌組織中頻率明顯較癌旁組織高，提示CC基因型可能是食管癌的易感基因型，IL-12B 3′UTR+16974位點基因多態性與食管癌發病有關。

體外研究證實，轉染IL-12基因的人臍帶間充質干細胞對卵巢癌細胞的體外增殖和對裸鼠體內移植瘤有明顯的抑制作用［16］；IL-12增強CIK細胞對食管癌EC9706細胞的殺傷活性［17］；小鼠骨髓間充質干細胞聯合IL-12重組質粒在荷瘤小鼠體內聯合應用可獲得更強的抗腫瘤活性［18］。體內研究證實，IL-12血清表達水平在腫瘤早期、組織分化程度較高、沒有轉移的情況下表達量高于晚期及組織分化程度低和發生了遠處轉移的患者［19］。

本研究發現，試驗組IL-12 p40和IL-12都異常高表達（P＜0.01），原因可能為試驗組均是適宜做手術的患者，食管癌未處于晚期。推測其理論基礎可能與機體發生細胞因子風暴有關，腫瘤發生時不斷刺激機體分泌IL-12以此來達到抗腫瘤的目的［20-21］。但隨著疾病惡化，免疫調節紊亂，機體抗腫瘤作用減弱，IL-12 p40和IL-12血清表達水平是否會出現降低，還有待進一步研究。

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Relationship between gene polymorphisms,serum expression level of IL-12B and esophageal cancer

PENG Lijuan1DU Jingwei2XU Jun3CHANG Jinxia1HU Weimin1PAN Wanlong1
1.Department of Microbiology and Immunology,North Sichuan Medical College,Sichuan Province,Nanchong637000, China;2.Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Central Hospital of Nanchong City,Sichuan Province, Nanchong637000,China;3.Department of Cardiothoracic Surgery,Central Hospital of Nanchong City,Sichuan Province,Nanchong637000,China

ObjectiveTo investigate relationship between interleukin(IL)-12B gene 3′untranslating region(UTR)+16974 (A/C)single nucleotide polymorphism,serum IL-12B level and esophageal cancer.Methods52 patients with esophageal cancer treated in Nanchong Central Hospital of Sichuan Province from June 2013 to June 2014 were randomly selected as experimental group.Esophageal carcinoma tissues and para-carcinoma tissues of 52 patients were collected after operation. DNA was extracted from these tissues.The genotype of the IL-12B 3′UTR+16974(A/C)polymorphisms were determined by polymerase chain reaction and sequencing.The patients with tumor tissues DNA were used as cancer tissues,and the adjacent 3-5 cm tissues were used as para-carcinoma tissues.The correlation between IL-12B gene polymorphism and tumor occurrence was analyzed.40 cases of healthy persons were selected as control group,at the same time,the serum of patients and healthy persons were collected.The serum expression level of IL-12 p40 and IL-12 were detected by enzymelinked immunosorbent assay.ResultsThe frequency of AA,AC and CC genotype in cancer tissues was 23.08%, 15.38%and 61.54%respectively,the frequency of AA,AC and CC genotype in para-carcinoma tissues was 15.38%, 38.46%and 46.15%respectively,with statistical difference(P＜0.05).The frequency of allele A and C in cancer tissues was 30.77%(32/104)and 69.23%(72/104)respectively,the frequency of allele A and C in para-carcinoma tissues was 34.62%(36/104),65.38%(68/104)respectively,there was no significant difference(P＞0.05).The serum expression levels of IL-12 p40 and IL-12 in experimental group were significantly higher than those in control group(P＜0.01).Con鄄clusionA/C polymorphism genotype CC of IL-12B 3′UTR+16974 site may be susceptible to esophageal cancer,the elevation of serum levels of IL-12 p40 and IL-12 are related to the occurrence of esophageal cancer.

Esophageal cancer;Interleukin-12;Interleukin-12B;Polymorphisms;Single nucleotide

R392.7

A

1673-7210（2015）12（a）-0020-04

2015-08-21本文編輯：李亞聰）

四川省教育廳自然科學類項目（15ZB0188）；四川省南充市科技局應用技術研究與開發資金項目（2010SF05）。

彭麗娟（1983-），女，碩士，從事醫學微生物學和免疫學教學及科研工作。