非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體基因突變檢測及其與臨床病理特征的關(guān)系

丁毅+張海萍+鐘山+付莉+白冬雨+張海芳

[摘要] 目的 探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）表皮生長因子受體（EGFR）基因突變情況及其與臨床病理的關(guān)系。方法 對2010年1月—2014年1月來該院診治的159份非小細(xì)胞肺癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)中采用基因測序方法對標(biāo)本中的EGFR基因突變情況進(jìn)行檢測，分析其與臨床病理的關(guān)系。結(jié)果 159例樣本中，EGFR基因突變檢出率12.6%（20/159），突變主要集中在19號外顯子的缺失和21號外顯子的點(diǎn)突變。女性患者基因突變檢出率明顯高于男性患者（P﹤0.01）。腺癌及細(xì)支氣管肺泡癌患者基因突變檢出率明顯高于其他組織學(xué)分型（P﹤0.01）。高分化患者基因突變檢出率高于中-低分化檢出率（P<0.05）。EGFR基因突變與年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無關(guān)（P>0.05）。 結(jié)論 非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型及分化程度密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 肺腫瘤；非小細(xì)胞肺癌；表皮生長因子受體；基因突變

[中圖分類號] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2014）10（a）-0009-03

相關(guān)研究表明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在43%～89%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中表達(dá)上調(diào)，參與細(xì)胞增殖、血管生成、抵抗凋亡和腫瘤侵襲，在腫瘤形成和介導(dǎo)瘤細(xì)胞的生物行為上發(fā)揮著重要作用，是目前NSCLC治療的重要靶點(diǎn)之一[1]。該研究就此主要研究非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變情況及其與臨床病理的關(guān)系，旨在為臨床治療提供靶點(diǎn)依據(jù)，現(xiàn)對2010年1月—2014年1月間來該院診治的159份非小細(xì)胞肺癌手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科收集的159份NSCLC手術(shù)切除標(biāo)本為研究對象，術(shù)前都未接受放化療治療。其中男性117例，女性42例，年齡范圍36～78歲，平均59歲，中位年齡61歲。按中位年齡分兩組（4例無年齡紀(jì)錄）：≤60歲 77例，>60歲 78例。組織學(xué)分型：腺癌63例，細(xì)支氣管肺泡癌16例，非腺癌80例（包括鱗癌53例、腺鱗癌10例、大細(xì)胞癌11例、黏液表皮樣癌2例、肉瘤樣癌4例）。

1.2 方法

①DNA提取。取蠟塊腫瘤組織切片，厚度為5～6 μm，5～10片，保存在無菌專業(yè)管（1.5 mL）中。把二甲苯脫蠟（鞍山市華昊化工廠）、乙醇洗脫二甲苯（青島新銳化學(xué)有限公司）（均由廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院專業(yè)醫(yī)師配置）加入管中，隨后將其晾干。再向每一根管中加入300 μL的裂解液及30 μL的蛋白酶K，水浴（55 ℃）3 h。100℃下滅活蛋白酶K5至10 min。然后每一根管中加入120 μL的飽和氯化鈉，均勻振蕩20 s，離心處上清，之后加入雙倍體積的乙醇（無水），零下20 ℃沉淀2 h。4 ℃離心20 min，速度為12 000 r/min，棄上清；加入一定量的乙醇（80%，冷），離心，真空抽干。最后利用紫外分光光度儀測量并保持樣本DNA純度為1.7～2.0之間。②PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：儀器設(shè)備為PCR擴(kuò)增儀（美國ABI-2700型），先95 ℃預(yù)變性，退火1 min，延伸1 min，循環(huán)10次，變性50 s，再分別退火、延伸1 min，循環(huán)30次，72攝氏度延伸10 min。回收并利用DNA純化試劑盒測量PCR產(chǎn)物凝膠電泳特異性條帶。③測序。運(yùn)行PCR程序，利用乙醇純化產(chǎn)物，用測序儀（美國ABI3730型）測序純化后的產(chǎn)物。所得結(jié)果與基因庫EGFR基因序列核對，所有病例均經(jīng)正向及反向測序。

1.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對EGFR基因突變檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因突變情況分析

159例NSCLC組織標(biāo)本中EGFR基因突變20例（12.6%），突變主要集中在19號外顯子的缺失和21號外顯子的點(diǎn)突變（90.5%），其中20號外顯子S768I、21號外顯子L861Q突變同在1例（0.6%）。見表1。

2.2 EGFR基因突變與臨床病理關(guān)系分析

在159例NSCLC患者中，女性患者EGFR基因突變率（31.0%，13/42）高于男性患者（6.0%，7/117），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=17.52，P<0.01）。腺癌和細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率（19%，12/63和37.5%，6/16）高于非腺癌患者（2.5%，2/80），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.38，P<0.01）；細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率（37.5%，6/16）高于腺癌患者（19%，12/63），但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.93，P>0.05）。高分化患者EGFR基因突變率（30.0%，6/20）高于中-低分化患者（10.1%，14/139），兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.31，P<0.05）。EGFR基因突變率與年齡及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.72，P>0.05）。見表2。

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，其中約80%是非小細(xì)胞肺癌，盡管隨著手術(shù)、放化療等治療手段的發(fā)展，肺癌的治療效果得到顯著提升，但目前肺癌的預(yù)后仍然很差，患者的5年生存率僅約15%[2]。目前，以吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼為代表的針對受體酪氨酸激酶家族中表皮生長因子受體（EGFR）的靶向藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用給NSCLC治療帶來了新的曙光[3-5]。EGFR是原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，具有酪氨酸激酶活性。相關(guān)文獻(xiàn)表明EGFR能和細(xì)胞外配體結(jié)合形成二聚體，通過刺激酪氨酸激酶活性讓二聚體出現(xiàn)自身磷酸化，讓信號轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)[6]。一旦EGFR基因突變，會直接參與到腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡抑制等過程中。EGFR酪氨酸激酶抑制劑可通過對腫瘤細(xì)胞EGFR的特異性結(jié)合阻斷細(xì)胞信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促其凋亡。

文獻(xiàn)報道[7-8]，不同人種之間EGFR基因突變率存在差異，東亞人群EGFR基因突變率約30%，高加索人群約10%。中國NSCLC患者EGFR基因總突變率約28.7%。該組福建地區(qū)159份非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中EGFR基因突變檢出率為12.6%，較國內(nèi)平均數(shù)據(jù)低，可能與檢測方法及不同的人群和地域有關(guān)，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證[9-10]。

該研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變表現(xiàn)在外顯子18～21，其中以19外顯子缺失、21外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹鳎贓GFR基因突變檢出中所占比例分別為19.0%（4/21）、71.4%（15/21），表明上述區(qū)域極有可能是靶向治療的敏感部位。另外，由表2可知，非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度有關(guān)。其中女性患者EGFR基因突變明顯高于男性患者，腺癌及細(xì)支氣管肺泡癌EGFR基因突變檢出率明顯高于其他分型檢出率。王芳等[11]報道，細(xì)支氣管肺泡癌及伴有細(xì)支氣管肺泡癌分化特征的腺癌EGFR基因突變率顯著高于普通腺癌，他們認(rèn)為腺癌中無論細(xì)支氣管肺泡癌成分的多少均預(yù)示EGFR突變的高發(fā)生率及對酪氨酸激酶抑制劑的高反應(yīng)率。該研究中細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率高于腺癌患者，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與張靜等[12]報道一致。該研究還發(fā)現(xiàn)高分化患者EGFR基因突變率高于中-低分化患者。

綜上，非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度息息相關(guān)，參與腫瘤浸潤、化療抗拒等過程，可作為非小細(xì)胞肺癌治療的一項(xiàng)重要靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Scagliotti GV， Selvaggi G， Novello S，et al. The biology of epidermal growth factor receptor in lung cancer[J]. Clin Cancer Res， 2004，10（12 Pt2）：4227-4232.

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[4] Zhou C，Wu YL，Chen G，et a1.Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer（OPTIMAL， CTONG-0802）： a multicentre，open-label，randomised，phase 3 study[J]. Lancet Oncol， 2011，12（8）：735-742.

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[8] 王國慶，谷雅君，王蓉，等.中國人非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與患者特征關(guān)系的Meta分析[J].中國醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2009，10（2）：55-57，60.

[9] 張曉彤，李龍蕓，王樹蘭，等.吉非替尼治療晚期非小細(xì)胞肺癌療效觀察[J].中華結(jié)核和呼吸雜志， 2012（28）：180-183.

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[11] 王芳.付莎.湯濤，等.非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體基因突變與臨床病理特征的關(guān)系[J].中華病理學(xué)雜志，2011，40（10）：664-666.

[12] 張靜，梁智勇，曾瑄，等.應(yīng)用蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)檢測非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體基因突變與病理改變的關(guān)系[J].中華病理學(xué)雜志，2008，37（5）：294-299.

（收稿日期：2014-06-29）

文獻(xiàn)報道[7-8]，不同人種之間EGFR基因突變率存在差異，東亞人群EGFR基因突變率約30%，高加索人群約10%。中國NSCLC患者EGFR基因總突變率約28.7%。該組福建地區(qū)159份非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中EGFR基因突變檢出率為12.6%，較國內(nèi)平均數(shù)據(jù)低，可能與檢測方法及不同的人群和地域有關(guān)，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證[9-10]。

該研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變表現(xiàn)在外顯子18～21，其中以19外顯子缺失、21外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹鳎贓GFR基因突變檢出中所占比例分別為19.0%（4/21）、71.4%（15/21），表明上述區(qū)域極有可能是靶向治療的敏感部位。另外，由表2可知，非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度有關(guān)。其中女性患者EGFR基因突變明顯高于男性患者，腺癌及細(xì)支氣管肺泡癌EGFR基因突變檢出率明顯高于其他分型檢出率。王芳等[11]報道，細(xì)支氣管肺泡癌及伴有細(xì)支氣管肺泡癌分化特征的腺癌EGFR基因突變率顯著高于普通腺癌，他們認(rèn)為腺癌中無論細(xì)支氣管肺泡癌成分的多少均預(yù)示EGFR突變的高發(fā)生率及對酪氨酸激酶抑制劑的高反應(yīng)率。該研究中細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率高于腺癌患者，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與張靜等[12]報道一致。該研究還發(fā)現(xiàn)高分化患者EGFR基因突變率高于中-低分化患者。

綜上，非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度息息相關(guān)，參與腫瘤浸潤、化療抗拒等過程，可作為非小細(xì)胞肺癌治療的一項(xiàng)重要靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2014-06-29）

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該研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變表現(xiàn)在外顯子18～21，其中以19外顯子缺失、21外顯子點(diǎn)突變?yōu)橹鳎贓GFR基因突變檢出中所占比例分別為19.0%（4/21）、71.4%（15/21），表明上述區(qū)域極有可能是靶向治療的敏感部位。另外，由表2可知，非小細(xì)胞肺癌中EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度有關(guān)。其中女性患者EGFR基因突變明顯高于男性患者，腺癌及細(xì)支氣管肺泡癌EGFR基因突變檢出率明顯高于其他分型檢出率。王芳等[11]報道，細(xì)支氣管肺泡癌及伴有細(xì)支氣管肺泡癌分化特征的腺癌EGFR基因突變率顯著高于普通腺癌，他們認(rèn)為腺癌中無論細(xì)支氣管肺泡癌成分的多少均預(yù)示EGFR突變的高發(fā)生率及對酪氨酸激酶抑制劑的高反應(yīng)率。該研究中細(xì)支氣管肺泡癌患者EGFR基因突變率高于腺癌患者，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與張靜等[12]報道一致。該研究還發(fā)現(xiàn)高分化患者EGFR基因突變率高于中-低分化患者。

綜上，非小細(xì)胞肺癌EGFR基因突變與性別、組織學(xué)分型、分化程度息息相關(guān)，參與腫瘤浸潤、化療抗拒等過程，可作為非小細(xì)胞肺癌治療的一項(xiàng)重要靶點(diǎn)。

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[12] 張靜，梁智勇，曾瑄，等.應(yīng)用蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)檢測非小細(xì)胞肺癌表皮生長因子受體基因突變與病理改變的關(guān)系[J].中華病理學(xué)雜志，2008，37（5）：294-299.

（收稿日期：2014-06-29）