丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對腦出血大鼠灶周內源性神經干細胞的影響研究

張 毅，方永軍，周 鋒，胡亞莉，柯尊華，周振國，羅 衛，暢 濤

·論著·

丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對腦出血大鼠灶周內源性神經干細胞的影響研究

張 毅，方永軍，周 鋒，胡亞莉，柯尊華，周振國，羅 衛，暢 濤

目的 觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對腦出血大鼠灶周內源性神經干細胞的影響。方法 將78只Sprague Dawley大鼠隨機分為正常組6只，假手術組24只，對照組24只及治療組24只。治療組、對照組、假手術組大鼠采用立體定向儀自體血注入法制備腦出血模型(假手術組大鼠只做刺入動作，不向腦內注血)，治療組大鼠造模后1 d開始腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，對照組及假手術組大鼠造模后1 d開始腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，正常組大鼠常規飼養，采用免疫組化染色觀察4組大鼠造模后第3天、7天、14天、28天灶周5-溴-2′-脫氧尿苷酸(BrdU)、神經元特異烯醇化酶(NSE)陽性細胞數。結果 造模后第3天、14天及28天治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞數多于假手術組和對照組(P<0.05)；造模后第7天治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞數多于正常組、假手術組及對照組，假手術組和對照組大鼠灶周BrdU陽性細胞數多于正常組(P<0.05)。治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞數在造模后第3天開始增多，到第7天時達峰值，此后逐漸下降。造模后第3天治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于假手術組，造模后第14天及28天治療組大鼠灶NSE陽性細胞數多于假手術組和對照組(P<0.05)；造模后第7天治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于正常組、假手術組及對照組，假手術組和對照組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于正常組(P<0.05)。假手術組、對照組和治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數在造模后呈進行性增多，并于造模后第28天達峰值。結論 丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可促進腦出血大鼠灶周內源性神經干細胞的增殖并誘導其向神經元分化。

丹參酮；腦出血；大鼠；神經干細胞

張毅，方永軍，周鋒，等.丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對腦出血大鼠灶周內源性神經干細胞的影響研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2015，23(10)：45-49.[www.syxnf.net]

Zhang Y，Fang YJ，Zhou F，et al.Impact of tanshinone ⅡA sulfonate sodium injection on peripheral endogenous neural stem cells of rats with cerebral hemorrhage[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2015，23(10)：45-49.

腦出血(intracerebral hemorrhage)的致死、致殘率較高，存活患者多遺留不同程度的功能殘疾。臨床研究顯示，內源性神經干細胞(neural stem cells)的激活、增殖及分化為腦出血提供了治療思路。丹參用于治療腦出血的歷史悠久，其主要成分丹參酮ⅡA具有良好的治療效果，能明顯促進腦出血患者神經功能的康復[1-2]。目前，有關丹參酮ⅡA的動物實驗研究多集中在缺血性腦血管疾病方面，有研究結果顯示，大鼠缺血前后應用丹參酮能促進雙側腦室管膜下區神經干細胞的增殖，并改善大鼠學習能力[3]。但有關丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液用于治療腦出血的動物實驗研究較少，為此，本研究建立了腦出血大鼠模型，旨在觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液對腦出血大鼠灶周內源性神經干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級成年健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠78只，年齡3～4個月，體質量250～300 g，由西安交通大學基礎醫學院實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器和試劑 腦立體定位儀(日本NARISHIGE SN-3型)，小型牙科鉆(韓國世新STRONG 204型)，光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(上海第一生化藥業有限公司)，小鼠抗大鼠5-溴-2′-脫氧尿苷酸(BrdU)單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，兔多克隆抗神經元特異烯醇化酶(NSE)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 動物分組及給藥 將78只SD大鼠隨機分為正常組(6只)、假手術組(24只)、對照組(24只)和治療組(24只)。治療組大鼠造模后1 d開始腹腔注射5 μg/ml的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液2 ml，1次/d，直至處死；假手術組及對照組大鼠造模后1 d開始腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2 ml，1次/d，直至處死。治療組、對照組及假手術組大鼠處死前1 d腹腔注射BrdU，50 mg·kg-1·次-1，1次/4 h，共3次。正常組大鼠常規飼養，并于第7天全部處死，其余3組大鼠分別在造模后第3天、7天、14天、28天各處死6只后取腦。

1.4 模型制備 采用立體定向儀自體血注入法[4]制備大鼠腦出血模型：治療組、對照組、假手術組大鼠稱重后用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，調節門齒托高度，使大鼠前后囟處于同一水平；碘伏消毒后沿頭皮正中切一長約10 mm的切口，無菌操作下暴露前囟，參照大鼠立體定位圖譜定位前囟前0.2 mm，中線右旁開3 mm，垂直進針5.5 mm，進入大鼠右側尾殼核區，用小型牙科鉆鉆透顱骨至硬腦膜處，停止鉆孔；穿刺股動脈，抽取非肝素抗凝自體動脈血進針至尾狀核，緩慢注入50 μl，2 min內勻速注入，緩慢將注射器完全退出，局部醫用骨蠟封閉，皮膚縫合，尾部切口加壓包扎。假手術組只做刺入動作，不向腦內注血，其余操作相同。術后將大鼠在 20 ℃～25 ℃恒溫條件下飼養，每3 d換墊料1次，自由活動及進食水。

1.5 神經功能測定 造模后參照 Bederson 評分標準[5]對大鼠進行評分。以大鼠完全清醒后的行為學改變來判斷模型制作是否成功。每組動物分別于造模后及處死之前進行神經功能評分，主要觀察其運動、感覺功能、平衡能力及生理反射能力，總分為4分，正常為0分，分值越高其神經損害越嚴重。評分標準，0分：無神經功能缺損體征；1分：提尾時損傷對側前肢屈曲；2分：前肢屈曲及損傷對側抵抗推力下降；3分：向損傷對側轉圈；4分：向損傷對側轉圈及意識模糊，低的生存率。1～4分為造模成功，造模不成功時補充大鼠。

1.6 標本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，開胸經左心室插管進行灌注，先用37 ℃ 0.9%氯化鈉溶液100 ml沖凈血液后，再用4%多聚甲醛灌注處死大鼠，待肝臟及肢體變硬后解剖取腦。

1.7 切片制作、免疫組化檢測 鼠腦標本用4%多聚甲醛浸泡4～6 h，在30%蔗糖溶液中過夜(4 ℃)至沉底，腦組織石蠟包埋切片，將大鼠腦組織以進針處為中心，冠狀位連續切片，厚約6 μm/片，每隔5張片取2張片，用防脫玻片直接貼附，室溫下晾干，-20 ℃下保存備用。免疫組化檢測嚴格按照試劑盒說明操作。BrdU陽性細胞表現為細胞核陽性，免疫組化染色呈紅色，卵圓形或圓形，標記具有增殖活性的細胞主要集中在側腦室外側壁上部、上角和海馬齒狀回，可以在側腦室外上角形成遷移流。NSE陽性細胞表現為細胞質陽性，免疫組化染色呈黃褐色，在側腦室下區和海馬齒狀回區表現為梭形或卵圓形。BrdU/NSE雙重免疫組化標記細胞，細胞核呈紅色，細胞質呈黃褐色。光鏡下采集圖像,用南京捷達JD-801圖像分析系統統計BrdU、NSE陽性細胞數。

2 結果

2.1 4組大鼠不同時間點灶周BrdU陽性細胞數比較 各組大鼠造模后第3天、7天、14天及28天灶周BrdU陽性細胞數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中造模后第3天、14天及28天治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞數多于假手術組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；造模后第7天治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞數多于正常組、假手術組及對照組，假手術組和對照組大鼠灶周BrdU陽性細胞數多于正常組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞數在造模后第3天開始增多，到第7天時達峰值，此后逐漸下降，見圖1～4。

Table 1 Comparison of peripheral BrdU-positive cell counts among the four groups at different time points

組別只數造模后第3天造模后第7天造模后第14天造模后第28天正常組6-49.33±10.15a--假手術組680.83±6.85a89.50±3.62ab79.33±2.66a72.00±2.45a對照組683.50±6.09a88.17±4.79ab78.67±3.61a71.83±3.25a治療組6110.83±6.43137.67±4.8998.17±10.5989.50±3.08F值39.58192.6416.6971.23P值0.000.000.000.00

注：與治療組比較，aP<0.05；與正常組比較，bP<0.05；-表示未測量

圖1 正常組大鼠灶周BrdU陽性細胞表達情況

注：A為造模后第3天(免疫組化染色，×100)，B為造模后第7天(免疫組化染色，×400)，C為造模后第14天(免疫組化染色，×400)，D為造模后第28天(免疫組化染色，×100)

圖2 對照組大鼠灶周BrdU陽性細胞表達情況

Figure 2 Expression of BrdU-positive cells of B group

注：A為造模后第3天，B為造模后第7天，C為造模后第14天，D為造模后第28天

圖3 假手術組大鼠灶周BrdU陽性細胞表達情況

(免疫組化染色，×100)

Figure 3 Expression of BrdU-positive cells of C group

2.2 4組大鼠不同時間點灶周NSE陽性細胞數比較 各組大鼠造模后第3天、7天、14天及28天灶周NSE陽性細胞數比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中造模后第3天治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于假手術組，造模后第14天及28天治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于假手術組和對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；造模后第7天治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于正常組、假手術組及對照組，假手術組和對照組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于正常組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。假手術組、對照組和治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數在造模后呈進行性增多，并于造模后第28天達峰值，見圖5～8。

注：A為造模后第3天(免疫組化染色，×400)，B為造模后第7天(免疫組化染色，×100)，C為造模后第14天(免疫組化染色，×400)，D為造模后第28天(免疫組化染色，×400)

圖4 治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞表達情況

Figure 4 Expression of BrdU-positive cells of D group

Table 2 Comparison of peripheral NSE-positive cell counts among the four groups at different time points

組別只數造模后第3天造模后第7天造模后第14天造模后第28天正常組6-0a--假手術組640.61±2.94a42.56±3.28ab45.38±2.89a50.06±2.39a對照組645.28±3.5747.31±3.53ab52.69±4.31a61.53±2.57a治療組647.46±4.6253.26±4.6063.84±3.4780.25±4.34F值5.1611.6639.92134.19P值0.020.000.000.00

注：與治療組比較，aP<0.05；與正常組比較，bP<0.05；-表示未測量

圖5 正常組大鼠灶周NSE陽性細胞表達情況

注：A為造模后第3天(免疫組化染色，×100)，B為造模后第7天(免疫組化染色，×100)，C為造模后第14天(免疫組化染色，×400)，D為造模后第28天(免疫組化染色，×400)

圖6 對照組大鼠灶周NSE陽性細胞表達情況

Figure 6 Expression of NSE-positive cells of B group

注：A為造模后第3天，B為造模后第7天，C為造模后第14天，D為造模后第28天

圖7 假手術組大鼠灶周NSE陽性細胞表達情況

(免疫組化染色，×100)

Figure 7 Expression of NSE-positive cells of C group

3 討論

神經干細胞是指具有分化為神經元細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞。以往認為神經干細胞只存在于胚胎中，近年來大量研究發現，成年腦腦室下區、海馬齒狀回、室管膜區等區域存在具有自我更新和多種分化潛能的神經干細胞[6]。疾病和創傷可誘導內源性神經干細胞的增殖、分化，但在未經干預的情況下，其自身誘導的修復能力有限，不足以完全恢復受損的神經。動物實驗研究表明，基底核腦出血大鼠病灶周圍可出現神經干細胞增殖[7]，但這種狀態下內源性神經干細胞的增殖能力及對腦出血后神經功能缺損的修復作用均有限[8]。原位誘導內源性神經干細胞既能促進神經功能修復，又能克服外源性神經干細胞移植的缺點，是治療腦出血理想的方法。有研究表明，中藥及其有效成分對腦出血后內源性神經干細胞的增殖有誘導作用。施建生等[9]對中等量腦出血大鼠應用人參總皂甙治療，在5個時間點與單純腦出血組灶周神經干細胞增殖情況進行比較，結果發現治療14、28、60 d治療組大鼠神經干細胞均多于單純腦出血組，提示腦出血后神經干細胞被激活增殖，人參總皂甙對腦出血后神經干細胞的增殖有促進作用，進而改善運動功能。

注：A為造模后第3天(免疫組化染色，×100)，B為造模后第7天(免疫組化染色，×100)，C為造模后第14天(免疫組化染色，×400)，D為造模后第28天(免疫組化染色，×100)

圖8 治療組大鼠灶周NSE陽性細胞表達情況

Figure 8 Expression of NSE-positive cells of D group

丹參及其有效成分丹參酮是治療腦卒中的常用藥物，臨床治療效果較好。丹參藥理作用廣泛，能保護心肌、擴張血管、抗動脈粥樣硬化、抗血栓、改善微循環、調節組織修復和再生、抗菌消炎[10]。丹參及其有效成分丹參酮在誘導干細胞增殖和分化方面也顯示出了巨大的潛力[11-12]。丹參酮ⅡA是從丹參中提取的脂溶性有效成分，為丹參的主要有效成分，可誘導干細胞分化。丹參酮ⅡA對多種細胞有生物學效應，包括誘導成人骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞，抑制瘢痕成纖維細胞的增殖等，并作為生物反應的輔酶對某些生化反應具有促進或干擾作用[13]。陳巖等[3]采用丹參酮治療腦缺血大鼠，結果顯示，丹參酮預處理能顯著增加去卵巢大鼠及腦缺血模型大鼠室管膜下區神經干細胞的數量，大鼠造腦缺血模型后應用丹參酮也能增加其室管膜下區神經干細胞的數量，并顯著改善其學習能力。臨床上，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液也用于治療腦出血，并有較好的臨床療效。

目前，鑒定神經干細胞主要有以下3個方面：特異性神經抗原的表達、自我更新能力及多向分化潛能，而鑒定神經干細胞的方法主要是細胞標志物。對神經干細胞進行BrdU摻入實驗，可幫助證實細胞是否具有自我更新能力。BrdU是胸腺嘧啶的同源替代物，可以在細胞周期的S期摻入到細胞核DNA內，如果神經干細胞在絲裂原的刺激下能夠進行增殖，就會將BrdU整合入細胞DNA。DNA鏈中只要有0.5%的胸腺嘧啶被其取代，就可以利用BrdU單抗標記技術檢測出來，該方法簡便、準確，無論是研究體內、體外神經干細胞的增殖和自我更新，還是進行移植前的標記，BrdU均被廣泛應用。而NSE、神經元特異性核蛋白(NeuN)是神經元表達的特異性標志抗原[14]。

本研究將丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液用于治療腦出血大鼠模型，結果顯示，治療組大鼠灶周BrdU陽性細胞數在造模后第3天開始增多，多于假手術組和對照組，到第7天時達峰值，此后逐漸下降，至第28天仍多于假手術組和對照組。假手術組、對照組和治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數在造模后呈進行性增多，并于造模后第28天達峰值，造模后第7天、14天及28天治療組大鼠灶周NSE陽性細胞數多于假手術組和對照組。提示丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可促進腦出血大鼠灶周內源性神經干細胞的增殖并誘導其向神經元分化。

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(本文編輯：謝武英)

Impact of Tanshinone ⅡA Sulfonate Sodium Injection on Peripheral Endogenous Neural Stem Cells of Rats with Cerebral Hemorrhage

ZHANGYi，FANGYong-jun，ZHOUFeng，etal.DepartmentofCerebralSurgery，theAffiliatedHospitalofShaanxiTraditionalChineseMedicineUniversity，Xianyang712000，China

Objective To observe the impact of tanshinone ⅡA sulfonate sodium injection on peripheral endogenous neural stem cells of rats with cerebral hemorrhage.Methods A total of 78 Sprague Dawley rats were randomly divided into groups A(n=6)，B(n=24)，C(n=24)and D(n=24)，stereotactic instrument and autologous blood injection method were used to prepare for cerebral hemorrhage model(rats of C group received puncture without intracerebral injection of autologous blood)，rats of A group were conventionally feed，rats of B group and C group received intraperitoneal injection of 0.9% sodium chloride injection after 1 day of preparation，while rats of D group received intraperitoneal injection of tanshinone ⅡA sulfonate sodium injection after 1 day of preparation.Immumohistochemical staining method was used to observe the peripheral BrdU-positive cell counts and peripheral NSE-positive cell counts after 3 days，7 days，14 days and 28 days of preparation.Results After 3 days，14 days and 28 days of preparation，peripheral BrdU-positive cell counts of D group were statistically significantly more than those of B group and C group(P<0.05)；after 7 days of preparation，peripheral BrdU-positive cell counts of D group were more than those of A group，B group and C group，and those of B group and C group were statistically significantly more than those of A group(P<0.05).Peripheral BrdU-positive cell counts of D group obviously increased at the third of preparation，and increased to the peak at the seventh day，and then gradually decreased.After 3 days of preparation，peripheral NSE-positive cell counts of D group were statistically significantly more than those of C group(P<0.05)；after 14 and 28 days of preparation，peripheral NSE-positive cell counts of D group were more than those of B group and C group(P<0.05)；after 7 days of preparation，peripheral NSE-positive cell counts of D group were more than those of A group，B group and C group，and those of B group and C group were statistically significantly more than those of A group(P<0.05).Peripheral NSE-positive cell counts of B group，C group and D group obviously increased after preparation，and increased to the peak at the 28th day.Conclusion Tanshinone ⅡA sulfonate sodium injection can promote the proliferation and induce the differentiation of peripheral endogenous neural stem cells of rats with cerebral hemorrhage.

Tanshinone；Cerebral hemorrhage；Rat；Neural stem cells

陜西省教育廳科學研究計劃項目(自然科學專項)(11JK0697)；陜西省科技廳科學技術研究發展計劃項目(自然基金)(2012JM4004)

712000陜西省咸陽市，陜西中醫藥大學附屬醫院腦外科(張毅，方永軍，周鋒，柯尊華，周振國，羅衛，暢濤)；陜西中醫藥大學(胡亞莉)

R 743.34

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2015.10.011

2015-07-12；

2015-09-13)