抗纖抑癌方干預大鼠肝癌前病變療效觀察

劉蕊潔 楊先照 張 鵬 焦云濤 葉永安

(北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100700)

抗纖抑癌方干預大鼠肝癌前病變療效觀察

劉蕊潔 楊先照 張 鵬 焦云濤 葉永安

(北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100700)

目的：通過對肝癌前病變大鼠予抗纖抑癌方灌胃給藥，結合肝臟病理及相關指標的免疫組化檢測，觀察抗纖抑癌方對肝癌前病變的治療作用。方法：將55只Wistar雄性大鼠隨機分為正常組10只、模型組15只、扶正化瘀組15只與抗纖抑癌組15只，除正常組外，其余各組以二乙基亞硝胺腹腔注射誘導肝癌前病變形成，每周1次，持續14周，同時每天分別以等計量生理鹽水、扶正化瘀膠囊及抗纖抑癌顆粒的水溶劑灌胃給藥，在第14周末給藥后取材，進行大鼠肝臟HE、Masson病理染色及FN、GST-Pi及PCNA指標的免疫組化檢測。結果：通過肝臟HE及Masson染色發現抗纖抑癌方較扶正化瘀膠囊可明顯改善肝癌前病變大鼠肝臟纖維堆積及肝細胞異常增生情況，免疫組化結果顯示抗纖抑癌方可明顯減少肝癌前病變時FN、GST-Pi及PCNA表達(均為P<0.01)，較扶正化瘀組也有較明顯的改善作用(分別為P<0.01、P<0.01及P<0.05)。結論：抗纖抑癌方具有改善肝癌前病變大鼠肝臟纖維堆積及肝細胞異常增生等作用，其作用機制有待進一步深入研究。

肝癌前病變;抗纖抑癌方;二乙基亞硝胺;療效觀察

肝細胞癌(簡稱“肝癌”)起病隱匿，預后極差，是全球致死性最高死亡腫瘤之一[1]。目前已公認肝癌的發生多經歷“慢性肝炎→肝硬化→肝癌前病變→肝癌”的病情進展，其中肝硬化是肝癌發生的獨立危險因素之一[2]。肝癌前病變以異型增生結節為形態學特征，是肝硬化結節進一步發展的結果，也是肝細胞癌變進展中啟動、促進和演變過程的中間階段，是阻斷癌變的理想時機，對肝癌前病變病理與治療方案的探索、研究，將有助于指導臨床治療。

經過長期理論探索與臨床實踐，我們發現肝癌前病變以肝郁脾虛，痰瘀互結為主要病機，據此創立了治療肝癌前病變的有效方劑——抗纖抑癌方。該方主要由柴胡、黃芪、山藥等組成，具有疏肝健脾、活血化痰等功效，本實驗研究將對抗纖抑癌方干預大鼠肝癌前病變進行初步療效觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠55只，體重約(180.5±6.8)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。給予大、小鼠維持飼料喂養，飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障環境動物實驗室，以上實驗方案報經北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物倫理委員會許可。

1.2 主要藥品及試劑 抗纖抑癌方：主要由柴胡、黃芪、山藥等組成，藥物免煎顆粒由培力(南寧)藥業有限公司生產，批號：A1401138；扶正化瘀膠囊：上海黃海制藥有限責任公司生產，批號：130943；GST-Pi單克隆抗體：Abcom公司生產，貨號：ab138491；4%多聚甲醛：索萊寶公司生產，貨號：P1110；PCNA單克隆抗體：Abcom公司生產，貨號：ab92552；免疫組化試劑盒：博奧森公司生產，貨號：SP-0023；HE染色試劑盒：索萊寶公司生產，貨號：G1120；Masson三色試劑盒：索萊寶公司生產，貨號：G1340；DAB顯色劑：中杉金橋公司生產，貨號：ZLI-9018.

1.3 主要儀器 自動病理脫水機：萊卡公司生產，型號：HI1210；包埋機：萊卡公司生產，型號：ASP200S；病理組織切片機：萊卡公司生產，型號：RM2235；光學顯微鏡：奧林巴斯公司生產，型號：CX31.

1.4 動物分組、造模、給藥及取材方法

1.4.1 分組及造模方法 55只Wistar雄性大鼠按照Excel隨機數字表法隨機分為正常組10只、模型組15只、扶正化瘀組15只與抗纖抑癌組15只，飼養于室溫20～23 ℃，相對濕度55%～70%，12 h光照、12 h黑暗交替環境，各組大鼠自由攝食攝水。除正常組以外，其余各組適應性飼養1周后，以二乙基亞硝胺(DEN)50 mg/kg劑量腹腔注射，正常組予0.4 mL/100 g 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，每周1次，持續14周。

1.4.2 給藥方法 造模開始即予灌胃給藥，正常組與模型組給予0.9%生理鹽水，按照1 mL/100 g劑量灌胃，1次/d；其余兩組按照臨床用量的6.25倍，按臨床60 kg成人用量進行計算，具體藥量如下：1)扶正化瘀膠囊：去掉扶正化瘀外膠囊，將粉末溶解于0.9%生理鹽水中，每毫升含藥量為0.028，按1 mL/100 g的劑量灌胃,1次/d；2)抗纖抑癌方：將中藥免煎顆粒溶解于0.9%生理鹽水中，每毫升含顆粒藥量為0.448 g，按1 mL/100 g的劑量灌胃，1次/d。以上4組連續給藥14周。

1.4.3 取材方法 于給藥后第14周末取材。配置10%水合氯醛溶液按照0.33 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，迅速摘取肝臟，取肝臟最大葉、距邊緣約1 cm的部位切取大小約1 cm×1 cm×0.3 cm組織塊，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后進行石蠟包埋、以4 μm厚度切片，按照相應試劑盒說明書進行HE、Masson染色及GST-Pi、PCNA及FN免疫組化檢測。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟HE染色(見圖1) 正常組大鼠肝細胞索放射狀排列，細胞質均質紅染，核圓形居中，匯管區無炎性細胞浸潤及無膽汁瘀積。模型組可見廣泛纖維間隔分割與假小葉形成，肝細胞變質與增生病變并存，變質主要為肝細胞的小滴脂變、細胞水腫，肝細胞壞死，增生病變表現為大量肝細胞異型增生灶及異型增生結節，肝細胞大小不等，細胞核增大，核/漿增高，核具有多形性，雙核、多核多見。扶正化瘀組也可見纖維間隔與假小葉形成，但假小葉不如模型組密集，細胞變質與增生病變并存。抗纖抑癌組纖維增生與假小葉形成程度輕于扶正化瘀組，肝細胞異常增生與細胞變質少于模型組及扶正化瘀組。

圖1 各組大鼠肝臟HE染色(×100)

2.2 各組大鼠肝臟Masson染色(見圖2) Masson特染可更好的反映纖維增生情況。正常組大鼠肝細胞間可見少量纖維組織。模型組明顯可見纖維條索分割肝小葉成更密集、體積更小的假小葉。扶正化瘀組中纖維間隔明顯，被纖維分割形成的假小葉面積大于模型組。抗纖抑癌組可見匯管區周圍纖維間隔形成，但纖維條索分割假小葉形成不明顯。

2.3 免疫組化檢測結果

2.3.1 各組FN比較(見圖3) 不可溶的纖維粘連蛋白(FN)陽性灶為棕黃色，在肝臟，主要存在于肝竇、基底膜與肝細胞之間、匯管區及纖維條索分割假小葉處。正常組可見少量FN存在，與模型組及扶正化瘀組均有統計學意義(P<0.01)，與抗纖抑癌組無統計學意義(P=0.145)；模型組與扶正化瘀組FN表達無統計學意義(P=0.199)，抗纖抑癌組FN較模型組及扶正化瘀組表達明顯減少，均存在統計學意義(P<0.01)。

圖2 各組大鼠肝臟Masson染色(×100)

圖3 各組FN比較(×400)

表1 各組大鼠肝臟FN IOD

注：**與模型組相比，P<0.01；△△與扶正化瘀組相比，P<0.01。

2.3.2 各組GST-Pi比較(見圖4) 谷胱甘肽S-轉移酶(GST-Pi)免疫組化陽性灶表現為不規則形棕黃色團塊，主要分布在肝細胞胞漿中。正常組表達較少，與其余3組間均存在統計學意義(P<0.01)，模型組及扶正化瘀組間無統計學意義(P>0.05)，抗纖抑癌組GST-Pi表達量低于模型組與扶正化瘀組，均有統計學意義(P<0.01)。

圖4 各組GST-Pi比較(×400)

表2 各組大鼠肝臟GST-Pi IOD比較

注：**與模型組相比，P<0.01；△△與扶正化瘀組相比，P<0.01。

圖5 各組PCNA比較(×400)

2.3.3 各組PCNA比較(見圖5) 增殖細胞核抗原(PCNA)在細胞核內合成，主要分布在肝細胞細胞核中，在正常肝臟細胞表達明顯少于其余3組(P<0.01)，模型組中PCNA表達顯著高于扶正化瘀組與抗纖抑癌組(P<0.01)，抗纖抑癌組PCNA表達量低于扶正化瘀組，有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠肝臟PCNA IOD

注：**與模型組相比，P<0.01；△△與扶正化瘀組相比，P<0.05。

3 討論

肝癌前病變多數情況下是發生在肝臟慢性病變如肝纖維化、肝硬化基礎上的肝細胞異常增生，是HCC發生的前奏與防治的重要階段。對于肝癌前病變發病機制的研究逐漸增多，研究內容已進入細胞和分子水平，越來越多的證據表明腫瘤的發生和進展是腫瘤細胞自身與其所處的環境共同作用的結果。肝癌前病變的發生既是肝細胞的變異，又與其所處的肝硬化微環境密切相關，是一個較為獨特的病理階段。

抗纖抑癌方以中醫理論為指導，經過長期臨床實踐創立，是治療肝癌前病變的有效方劑，通過本實驗證實，抗纖抑癌方可從抑制肝癌前病變細胞異常增生、調整細胞微環境這兩個相對獨立又相互關聯的方面著手，有效抑制肝癌前病變的發生、發展。

肝癌前病變的病理以肉眼可見較大增生結節，HE染色下見到肝硬化基礎上的小細胞增生伴高級別異型增生結節為特征[3]。模型組大鼠肝臟HE染色可見肝細胞多處變性、壞死，在肝硬化基礎上形成以細胞核增大、核/漿增高及細胞核具有多形性為特點的異型增生灶，扶正化瘀組及抗纖抑癌組肝細胞變質與增生病變輕于模型組，其中尤以抗纖抑癌組為輕。Masson染色顯示各組纖維化情況與HE類似。由以上研究可見，抗纖抑癌方能有效減輕大鼠肝癌前病變肝硬化纖維堆積程度、減輕大鼠肝臟細胞變性與壞死，以及減少肝細胞異形性及異型增生結節。

胎盤型谷胱甘肽轉移酶GST-Pi在多種惡性腫瘤中均有表達，在癌前狀態及分化較好的腫瘤中表達升高，被認為是檢測“癌癥啟動細胞”最準確、最早的標志酶，其陽性灶數目與癌細胞增殖多少正相關[4]。增殖細胞核抗原PCNA與DNA合成關系密切，是反應細胞增殖的良好指標，在具有旺盛增殖活性的腫瘤細胞中表達較高，與腫瘤的發生、發展及分級呈正相關[5]。本實驗免疫組化結果顯示，抗纖抑癌方可顯著減輕肝癌前病變大鼠肝臟GST-Pi與PCNA陽性灶含量，其中抗纖抑癌組GST-Pi與模型組、扶正化瘀組相比均有顯著的統計學意義(P<0.01)，抗纖抑癌組PCNA與模型組、扶正化瘀組相比均有統計學意義(分別為P<0.01、P<0.05)，提示抗纖抑癌方對減緩肝癌前病變細胞異常增殖有一定功效。

FN主要在肝血竇內皮細胞生成，是構成細胞外基質的主要成分之一，具有促進肝星狀細胞的活化、細胞外基質合成，以及抑制細胞外基質降解的作用，在肝纖維化早期即有明顯升高，是較肝星狀細胞(HSC)活化、I型膠原沉積更為早期的病理表現之一[6]。FN在正常細胞、組織中也有表達，本實驗結果顯示抗纖抑癌組大鼠肝臟免疫組化FN均顯著低于模型組與扶正化瘀組(P<0.01)，結合我們前期研究顯示該方對于HSC、α-SMA的抑制作用，提示抗纖抑癌方可通過抑制FN合成發揮抗纖維化、改善肝癌前病變微環境等作用。

綜上，通過本研究發現，抗纖抑癌方具有明顯的改善肝癌前病變大鼠肝臟纖維堆積及肝細胞異常增生等作用，而該方劑抑制肝癌前病變發生的機制，值得進一步深入研究。

[1]Anna-Maria T，Traian D，Simona D，et al.Influence of hepatitis viruses on clinic opathological profiles and long-term outcome in patients undergoing surgery for hepatocellular carcinoma [J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2014,13(2)：162-172.

[2]Silvana C.Faria，Janio Szklaruk，Ahmed O.Kaseb，et al.TNM/Okuda/Barcelona/UNOS/CLIP International Multidisciplinary Classification of Hepatocellular Carcinoma：concepts，perspectives，and radiologic implications [J].Abdom Imaging，2014，39(5)：1070-1087.

[3]Yujin H，Bryan C.F，Kenneth K.T.Prevention of hepatocellular carcinoma：potential targets，experimental models，and clinical challenges [J].Curr Cancer Drug Targets，2012，12(9)：1129-1159.

[4]Khabaz MN.Polymorphism of the glutathione S-transferase Pi gene(GST-pi)in breast carcinoma [J].Pol J Pathol，2014，65(2)：141-146.

[5]丁印魯,趙榮字,由翠珍,等.PCNA在肝細胞癌中的表達及其臨床意義[J].大連醫科大學學報，2002，24(1),25-27.

[6]宣紅萍，孫保木，陶艷艷，等.肝纖維化過程中整合素α5β1動態變化與扶正化瘀方干預作用[J].肝臟，2004，9(3)：163-166.

(2015-08-20收稿 責任編輯：洪志強)

Efficacy Observation on Kangxian Yi'ai Formula in Rats with Liver Precancerous Lesions

Liu Ruijie, Yang Xianzhao, Zhang Peng, Jiao Yuntao, Ye Yong'an

(DongzhimenHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective: To observe the efficacy of Kangxian Yi'Ai formula on liver precancerous lesions through immunohistochemistry test by gastric administration in rats.Methods:To randomly divide 55 male Wistar rats into four groups: 10 in the normal group, 10 in the model group, 15 in the Fuzheng Huayu capsule group and 15 in the Kangxian Yi'ai formula group respectively. Diethylnitrosamine had been given to induce liver precancerous lesions in all groups except the normal group for 14 weeks, once a week. Meanwhile, besides the normal group, saline, Fuzheng Huayu capsule and Kangxian Yi'ai fomula were also given the same dosage at each time in respective groups. At the end of the 14th week, tissues were taken to test the pathology of the liver, together with the IHC index included GST-Pi, PCNA and FN. Results: The liver HE and Masson staining showed that Kangxian Yi'ai formula could reduce the cirrhosis degree and the size of lesions much obviously than Fuzheng Huayu capsule did. In addition, the Kangxian Yi'Ai formula could reduced the FN, GST-Pi and PCNA much greatly than the control group (P<0.05) and the Fuzheng Huauu group (P<0.01,P<0.01 andP<0.05). Conclusion: Kangxian Yi'ai formula could constrain cirrhosis and the liver precancerous lesions induced by diethylnitrosamine in rats, but its mechanism is yet to be found.

Liver precancerous lesions; KangXianYi-Ai formula; Diethylnitrosamine; Efficacy observation

高等學校博士學科點專項科研基金博導類資助課題(編號：20130013110006)

葉永安，教授，博士研究生導師，主要研究方向：中醫藥防治慢性肝病的臨床與基礎研究，E-mail：yeyongan@vip.163.com

R229

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.004