真武湯對糖尿病腎病患者血管內皮生長因子及尿蛋白排泄率的影響

曾偉平 徐孝容 柳 清

(四川省簡陽市中醫醫院，簡陽，641400)

真武湯對糖尿病腎病患者血管內皮生長因子及尿蛋白排泄率的影響

曾偉平 徐孝容 柳 清

(四川省簡陽市中醫醫院，簡陽，641400)

目的：分析真武湯對糖尿病腎病患者血管內皮生長因子及尿蛋白排泄率的影響。方法：將本院收治的70例2型糖尿病腎病患者根據入院順序隨機分為對照組(35例)和治療組(35例)，2組患者均接受糖尿病教育、糖尿病飲食，內科口服降糖藥物或者皮下注射胰島素治療(劑量依照患者血糖水平而設定)；合并高血壓者加用硝苯地平緩釋片，10～20 mg，2次/d；合并高脂血癥者加服辛伐他汀，20 mg/d。治療組在對照組基礎上運用真武湯,2組均以8周為1個療程，比較2組治療前后蛋白尿排泄率(uAER)及VEGF蛋白和mRNA的變化。結果：1)2組經過治療uAER均較治療前改善，其中治療組改善的幅度更為明顯(P<0.05)，說明真武湯可明顯改善糖尿病腎病患者的uAER，在一定程度上抑制了糖尿病腎病病情的進展。2)經過治療2組的VEGF蛋白和mRNA表達均有所下降，其中治療組下降的趨勢較對照組明顯(P<0.05)，說明聯合使用中藥方可以使VEGF在蛋白和基因層面上均收到抑制。3)uAER與VEGF水平呈非正態分布，使用Spearman法進行相關參數相關性分析，結果發現uAER與VEGF的表達存在正相關性。結論：真武湯可降低糖尿病腎病患者血清VEGF水平，同時降低uAER，是其保護腎功能的可能作用機制之一。

糖尿病腎病；尿蛋白排泄率；血管內皮生長因子；真武湯

隨著現代生活飲食結構的不斷變化，糖尿病的發病率逐年上調，隨之導致糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DKD)的發病率亦上升，具最新調查研究發現據最新統計[1]，我國目前約有5 000萬人正面臨著糖尿病的威脅。DKD的發生是一個緩慢的漸進過程，腎功能的早期損害存在可逆性，故探尋可敏感評估DKD早期病變的生物學指標勢在必行。隨著現代醫療手段的逐步提升，我們發現腎臟血管增生病變與DKD的發生存在密切關聯，一項多中心大樣本[2]關于尿毒癥病因譜調查顯示，糖尿病是導致尿毒癥發生的主要原因之一，僅次于慢性腎炎。因此我們有理由相信科學合理的治療糖尿病可部分逆轉腎損害。血管內皮細胞生長因子(Vascuoar Endothelial Growth Factor，VEGF)是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生，保護血管內皮功能，是影響微循環系統功能主要因子之一。Doi K[3]發現注射VEGF抑制劑可促進糖尿病模型大鼠糖尿病癥狀。彭小靜[4]等通過降低大鼠血漿中VEGF的水平實現了加速大鼠創面修復的目的。

中醫古籍無對DKD進行記載，多歸結于“消渴”“水腫”“脹滿”“關格”等范疇，臟氣虛衰、瘀血阻滯、水濕內停是其主要病機。由于各類西藥都可能產生不同程度的不良反應，糖尿病腎病患者較難耐受。所以，探尋更安全有效的糖尿病腎病癥治療方案尤其重要，中藥湯藥的治療價值逐漸受到重視。《真武湯》源自《傷寒論》，屬于溫陽利水經典方，近千年的臨床驗證，證實該方在內外婦女各科均有理想療效。本研究將70例糖尿病腎病患者納入研究，利用真武湯為主方，根據患者不同伴隨癥狀進行加味，具體如下：

1 臨床治療及方法

1.1 一般資料 將本院2009年1月至2013年1月70例糖尿病腎病患者納入本研究，其中男性41例，女性29例，年齡32～61歲，平均(44±5)歲，病程3～19年，平均(9±2)年。并發癥：肥胖13例，高血壓15例，高脂血癥9例。所有患者符合以下標準：1)2010年中華醫學會頒布的《中醫內科常見病診療指南》中關于糖尿病腎病的診斷標準[5]；2)尿蛋白排泄率20～200 μg/min；3)簽署知情同意書。2組患者根據數字隨機法分為對照組及治療組，2組患者的年齡、性別、基礎疾病構成、病程等方面比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。具有均衡性和可比性。本研究方案經過醫院倫理學委員會審查批準。

1.2 排除標準 1)嚴重肝臟、腎臟、或心功能異常者；2)近3個月內有血管活化劑、抗血小板藥物使用史；3)惡性腫瘤及重癥感染患者；4)糖尿病急性代謝性并發癥者；5)妊娠期、哺乳期婦女；6)精神異常/認知功能障礙患者；7)不予簽署知情同意書患者。

1.3 治療方法 2組患者均接受糖尿病教育、糖尿病飲食，內科口服降糖藥物或者皮下注射胰島素治療(劑量依照患者血糖水平而設定)；合并高血壓者加用硝苯地平緩釋片(國藥準：H32026198)，10～20 mg，2次/d；合并高脂血癥者加服辛伐他汀(京必舒新批準文號：國藥準字H20000009)，20 mg/d。治療組在上述治療方案基礎上加用真武湯，具體方藥如下：制附子20 g(先煎)，白術10 g，茯苓20 g，澤瀉15 g，生姜12 g，白芍10 g，豬苓15 g，玉米須10 g，丹參20 g，黃芪20 g，大黃12 g。頭暈嚴重者加天麻9 g，鉤藤9 g；四肢冰冷明顯者加肉桂9 g；四肢麻痹明顯者加桑枝9 g，地龍12 g；嘔吐者加用半夏6 g、藿香9 g。2組均以8周為1個療程。

1.4 觀察指標

1.4.1 蛋白尿排泄率 留取患者24 h尿液，加入Dimethylbenzene(二甲苯)進行防腐，采用放射免疫法對尿蛋白Alb進行測定，然后根據尿液的容積和所得Alb數值計算出蛋白尿排泄率(uAER)。

1.4.2 VEGF蛋白濃度檢測 研究對象空腹，無菌情況下用無肝素真空采血管采集肘靜脈血5 mL，1 h內，用3 000 r/min轉速離心10 min，使用高壓槍頭吸取離心后的上清液，送至醫院檢驗中心，應用全自動生化分析儀(日立7180型)檢測VEGF濃度。使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測，包被、封閉酶標反應孔、洗滌、加入待檢測樣品、加入酶標抗體、加入底物液、終止反應等過程均嚴格按照說明書進行，試劑盒由廣州達安基因股份有限公司提供，OPD顯色后采用492 nm波長,TMB反應產物檢測需要450 nm波長。檢測時一定要首先進行空白孔系統調零。用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(P/N)表示。操作過程全部按照IL-6、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.4.3 VEGF mRNA水平檢測 取不同組別患者治療前及治10周后前臂外周抗凝血5 mL，加入適量淋巴細胞分離液。隨后取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液充分混勻，使用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞，根據每107數量的細胞加入1 mL Trizol的比例進行裂解，震蕩30 s；加0.2 mL氯仿，12 000 g，4 ℃離心，15 min；輕輕吸取上層無色水相至0.5 mL EP管中；加等體積異丙醇后4 ℃離心，12 000 g，10 min；在管底部可見微量RNA沉淀。加入75%乙醇1 mL，棄上清，干燥后用DEPC水溶解RNA，根據所RNA濃度，計算RNA體積。按照逆轉錄試劑盒以及相關引物說明書加入相應量的試劑進行聚合酶鏈反應，VEGF引物序列：F ATTGAGACCCTGGTGGAC，R CCTATGTGCTGGCTTTGG；β-actin引物序列：F TGACAGGATGCAGAAGGAGA，R GCTGGAAGGTGGACAGTGAG。取PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像。BIO-LAB圖像軟件分析電泳條帶。

2 結果

2.1 2組uAER比較 2組經過治療uAER均較治療前改善，其中治療組改善的幅度更為明顯(P<0.05)，說明真武湯可明顯改善糖尿病腎病患者的uAER，在一定程度上抑制了糖尿病腎病病情的進展。具體見表1。

表1 2組uAER療效比較

注：與治療前相比*P<0.05，與對照組相比,△P<0.05。

2.2 2組VEGF蛋白和mRNA的表達變化 經過治療2組的VEGF蛋白和mRNA表達均有所下降，其中治療組下降的趨勢較對照組明顯(P<0.05)，說明聯合使用真武湯可以使VEGF在蛋白和基因層面上均受到抑制。具體見表2、圖1和圖2。

表2 2組VEGF蛋白變化比較

注：與治療前相比*P<0.05，與對照組相比,△P<0.05。

2.3 uAER與VEGF之間的相關性分析 uAER與VEGF水平呈非正態分布，使用Spearman法進行相關參數相關性分析，結果發現uAER與VEGF的表達存在正相關性，具體見表3。

圖1 2組治療前后VEGF mRNA的比較

圖2 2組VEGF與內參的mRNA灰度比較的比較

表3 相關性分析

3 討論

糖尿病繼發的腎損傷屬于進展性疾病，糖尿病早期腎體積增大，腎小球濾過率增加，呈高濾過狀態，以后逐漸出現間隙蛋白尿或微量白蛋白尿，隨著病程的延長出現持續蛋白尿、水腫、高血壓、腎小球濾過率降低，進而發展為腎功能不全、尿毒癥，一旦進入終末期腎病5年存活率僅為27%[6]。有資料顯示2型糖尿病導致的腎功能損傷在一定程度上具有可逆性，認為在DKD疾病早期進行干預尤為重要，因此本研究納入患者尿蛋白排泄率20～200 μg/min，即對早期DKD進行觀察并干預。

VEGF是一種小分子蛋白質，在正常的生理狀態下，VEGF在血漿呈低表達，以低量的表達維持血管的完整性，它通過與血管內皮細胞上的酪氨酸激酶受體結合發揮生物學作用[6-9]。在病理狀態下，局部組織缺血缺氧使微血管發生病變，VEGF過度表達，促進血管的通透性，導致尿蛋白的滲漏，從而導致腎功能的進一步破壞。VEGF在腎損傷臨床患者及動物模型具有高表達均已得到證實[10-15]，因此降低DKD患者VEGF的表達量應該可以達到改善腎功能的目的。本研究對照組患者接受內科常規治療，患者治療后的uAER得到一定程度的改善，且同時我們發現對照組患者外周血漿中VEGF表達量得到下調，因此對照組患者腎功能改善的可能原因應該是通過下調VEGF表達有關。由于各類西藥都可能產生不同程度的不良反應，糖尿病腎病患者較難耐受，因此本研究對根據DKD中醫病機自擬中藥方對35例治療組患者進行治療，我們發現不論是在降低uAER還是下調VEGF蛋白及mRNA的表達輔助中藥的患者改善均較對照組明顯，我們認為真武湯原方雖僅有5味藥，方中以附子大辛大熱，溫壯腎中陽氣，以散在里之寒水為主藥；輔以生姜溫散水氣，茯苓、白術健脾利水，以抵抗DKD中水濕內停的病機而發揮療效；白芍斂陰和里，并制熟附子、生姜之辛燥，使利水而不傷陰。我們還發現古今諸多文獻對于白芍一味在不同疾病的使用有諸多不同論述，“水濕內停”是其使用的關鍵點，水濕難化內停是DKD重要病機之一，故本研究使用白芍發揮輔助疏泄肝氣、開水液下行之路的作用。方中我們加味黃芪，黃芪性味甘溫，具有補氣固表，利尿托毒的功效，具有增強機體免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗應激、降壓和較廣泛的抗菌作用；丹參活血化瘀，現代藥理證實具有擴張腎血管、改善腎臟局部血流、抗血栓的作用，從而達到腎保護的目的；大黃增強本方化濁解毒的功效，減少代產物對腎功能的毒害，藥理研究發現大黃提取物可減少單核巨噬細胞的浸潤，改善腎臟組織間質的炎癥。全方共奏溫補脾腎，助陽利水之功效。

我們還對uAER與VEGF的相關性進行了統計分析，發現二者存在正相關關系，于是我們有理由相信將uAER與VEGF聯合評估DKD是可行。總之，DKD的發生與VEGF濃度變化具有密切關系，而真武湯可以通過降低VEGF濃度達到逆轉DKD的發展。但由于本研究隨訪時間較短、樣本量較少，以期在下階段增大樣本量、延長隨訪時間，進一步證實真武湯改善DKD預后的明確機制，以指導臨床用藥。

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(2014-12-08收稿 責任編輯：徐穎)

The Effects of Spleen-Yang Strengthening Decoction on Vascular Endothelial Growth Factor and Urinary Protein Excretion Rate in Patients With Diabetic Nephropathy

Zeng Weiping,Xu Xiaorong,Liu Qing

(JianyangCityHospitalofTraditionalChineseMedicine，Jianyang641400，China)

Objective:To analyze the impact of Spleen-yang Strengthening Decoction on vascular endothelial growth factor and urinary protein excretion rate in patients with diabetic nephropathy.Methods:Seventy cases of patients with Type 2 Diabetic nephropathy who were received and treated in our hospital were randomly divided into the control group (35 cases) and the observation group (35 cases) according to admission order, both of the two groups received Diabetes Education, Diabetic diet, internal medicine oral hypoglycemic agents or subcutaneous injections of insulin (the dose were set according to blood glucose levels of the patients); the patients who combined with hypertension were added nifedipine sustained release tablets, 10～20 mg, 2 times/day. The patients who combined with hyperlipidemia were added Simvastatin, 20 mg/day. The observation group used Self-prepared kidney invigorating decoction on the basis of the control group. Both groups had 8 weeks for a course of treatment, urinary protein excretion rate (uAER) and the protein and mRNA change of VEGF in the two groups were compared before and after the treatment.Results:1) uAER improved in the two groups after treatment compared to before the treatment, the range of improvement in the observation group was more obvious (P<0.05). This illustrated that Self-prepared kidney invigorating decoction can obviously significantly improve uAER of the patients with diabetic nephropathy, inhibited the progression of diabetic nephropathy in a certain extent. 2) after treatment, protein and mRNA expression of VEGF in the two groups decreased, the downward trend in the observation group were more obvious than the control group (P<0.05), illustrated the combine use of prescription could suppress the VEGF in the protein and gene levels. 3) uAER and VEGF levels were in abnormal distribution, correlation analysis were proceed on relevant parameters by the method of Spearman, the results found that uAER had positive correlation with the expression of VEGF.Conclusion:Spleen-yang Strengthening Decoction can reduce the serum VEGF level in patients with diabetic nephropathy, and can reduce uAER at the same time, which could possibly be the mechanism of action to protect renal function.

Diabetic nephropathy; Urinary protein excretion rate; Vascular endothelial growth factor; S Spleen-yang Strengthening Decoction

國家自然科學基金項目“基于腎陽虛體質研究少、長、壯、老腎陽盛衰的基因調控”(編號：30973690)

曾偉平(1982—)，碩士，主治中醫師，四川省簡陽市中醫醫院，研究方向：慢性腎臟病中西醫臨床治療

R243;R587.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.09.015