牛角瓜花粉離體萌發研究

劉 鵬，張太奎，王連春，鄭 元，葉維雁，劉惠民

（西南林業大學林學院，云南 昆明 650224）

牛角瓜花粉離體萌發研究

劉 鵬，張太奎，王連春，鄭 元，葉維雁，劉惠民

（西南林業大學林學院，云南 昆明 650224）

為了探討牛角瓜花粉離體萌發的最適條件及培養基成分，以2年生牛角瓜新鮮花粉為試材，研究了不同溶液對牛角瓜花粉塊壁解離效果的影響情況；還采用離體培養法，研究了不同培養溫度和培養時間、不同培養基組分對牛角瓜花粉萌發率和花粉管生長的影響情況。結果顯示：以10% 的NaOH溶液將牛角瓜花粉塊處理10 min的解離效果最好；牛角瓜花粉離體萌發的最適溫度為30 ℃，在此溫度條件下培養6 h后其花粉萌發率基本穩定，培養12 h后其花粉管生長最好；蔗糖對牛角瓜花粉萌發率及花粉管長度的影響均較大，硼酸對花粉萌發率及花粉管長度的影響均較?。慌＝枪匣ǚ勖劝l和花粉管生長的最適培養基為20%蔗糖＋0.1%硼酸＋5 mg/L氯化鈣＋15 mg/L 6-BA，在此培養基上并在30 ℃的溫度條件下培養6 h，其花粉萌發率達到94.77%，花粉管長度為11.07 mm。

牛角瓜；花粉塊壁；花粉萌發；花粉管生長；離體培養

牛角瓜為蘿藦科Asclepiadaceae牛角瓜屬Calotropis常綠灌木或小喬木，有哮喘樹、羊浸樹、斷腸草、五狗臥花等別名，在我國產于云南、四川、廣西和廣東等南方省區，有很高的經濟和藥用價值[1-5]。其莖皮纖維可用以造紙、制繩索及生產人造棉，也可用以織麻布、麻袋，其種毛可用作絲絨原料及填充物，是一種很有開發潛力的纖維經濟作物，也是一種生態環保的新型纖維材料；牛角瓜還是一種藥用植物，其莖、葉的乳汁含牛角瓜甙等種強心甙和牛角瓜堿，可用來治療皮膚癬、痢疾、風濕等疾病。蘿藦科植物的花粉與蘭科植物相似，是由一層薄膜包裹而形成的花粉塊。牛角瓜的兩性花具有花粉塊這一特殊結構，其花粉成熟后，不會散開，直至傳粉成功后，花粉粒一般也不散出，在花粉塊內直接萌發，因此有必要找到一種化學試劑以解除這層包裹著花粉粒的薄膜，從而為其后期花粉離體萌發試驗做好準備。迄今為止，有關牛角瓜的研究報道較少，尚未見到有關牛角瓜花粉離體萌發的相關研究報道。有關研究者在對其野外調查中發現，牛角瓜自然坐果率低，這極大地制約了牛角瓜栽培生產的發展。雜交育種是提高其產量、改良其品質的重要手段，而雜交親本花粉生活力的高低直接影響到育種的成敗[6]，因為花粉具有萌發活力，這是完成受精的必要條件，也是決定其坐果率的前提[7]。牛角瓜的花粉活力與其自然坐果率直接相關，而花粉萌發率和花粉管長度是鑒定花粉活力的兩個基本指標。因此，文中以2年生牛角瓜新鮮花粉為試驗材料，研究了不同溶液對牛角瓜花粉塊壁解離程度的影響情況，還采用離體培養法，研究了不同培養溫度、培養時間、培養基組分對牛角瓜花粉萌發率及花粉管生長的影響情況，旨在尋求最適合牛角瓜花粉萌發的培養配方及最適培養條件，從而為其人工輔助授粉、育種工作，為牛角瓜生殖生物學、種質資源保存等方面的研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗以云南省元江縣林業局種苗站內牛角瓜基地（東經 101°58′12.8″、北緯 23°36′5.7″）的 2 年生牛角瓜為材料，采摘當天開放的花朵，放入自封袋中迅速帶回實驗室，用解剖針小心地將每朵花的5個花粉塊取出，以備花粉塊壁解離試驗與花粉離體萌發試驗使用。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉塊壁解離試驗方法

將牛角瓜花粉塊放入凹形載玻片中，用6種不同溶液（蒸餾水，5%、10%、20%的NaOH溶液，5%、10%、20%的HCl溶液，5%、10%的次氯酸鈉溶液，二甲苯溶液，乙酸異戊酯溶液）分別浸泡5、10、20 min；然后將以每種方法處理后的花粉塊各用蒸餾水清洗2遍，再在解剖鏡下進行人工剝離，去除花粉塊壁，以判斷溶液處理后花粉塊壁的分離程度[8]。每個處理5個花粉塊，重復3次。

1.2.2 花粉離體培養方法

將花粉塊置于凹形載玻片中，加入已配好的100 μL液體培養基，放入鋪有濕濾紙的培養皿中進行保濕培養。培養結束后，用解剖針小心取出已萌發的花粉塊，將其置于花粉塊壁解離試驗效果最佳的溶液中進行處理，然后放在普通載破片上，加蓋破片小心擠壓，再置于Nikon光學顯微鏡下觀察，每個視野觀察的花粉數不少于50個，以花粉管長度大于花粉粒直徑視為萌發，并選取50個花粉測定其花粉管長度。各處理均重復3次。

1.2.3 最佳培養條件的選擇試驗

采用10%蔗糖＋0.1%硼酸＋5 mg/L氯化鈣＋15 mg/L 6-BA的培養基；在培養溫度分別為25、30、35和40 ℃，培養時間分別為1、2、3、6、12 h的條件下，對牛角瓜花粉進行離體培養試驗，以確定其萌發和花粉管生長的最適條件。每個處理5個花粉塊，重復3次。

1.2.4 不同培養基的選擇試驗

以5 mg/L的氯化鈣和15 mg/L的6-BA為基本培養基，采用L9(34)的正交試驗設計，以培養基中的蔗糖（A）、硼酸（B）兩個成分作為試驗因素，就其各個試驗水平對牛角瓜花粉離體萌發的影響情況進行正交試驗，試驗因素與水平詳見表1。每個處理5個花粉塊，重復3次。

表 1 不同培養基對牛角瓜花粉離體萌發影響的正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test of the effectof differentmedia on germination in vitro of C.gigantean pollens %

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗結果進行多重比較及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同溶液處理對花粉塊壁解離效果的影響

萌發后的花粉仍被蠟質薄膜所包裹（如圖1A所示），為了計算牛角瓜花粉的萌發率及測量花粉管的長度，有必要解離這層薄膜以釋放出花粉粒來。本研究選取了不同濃度的NaOH、HCl及NaClO溶液和蒸餾水、二甲苯、乙酸異戊酯這六種溶液對牛角瓜花粉塊壁進行解離試驗。不同濃度的溶液處理對牛角瓜花粉塊壁解離程度的影響情況見表2。由表2可知，在處理5 min時，20%的NaOH溶液對牛角瓜花粉塊壁的分離效果最好，其次分別為5%、10%的 NaOH溶液，而蒸餾水、乙酸異戊酯溶液對牛角瓜花粉塊壁均無解離作用。在處理10 min時，10% 和20%的NaOH溶液對牛角瓜花粉塊壁的解離效果同時達到最佳，5%的HCl、5%的NaOH溶液與5%、10%的NaClO溶液次之，而蒸餾水、乙酸異戊酯溶液對牛角瓜花粉塊壁均沒有解離作用。在處理20 min時，10%和20%的NaOH溶液對牛角瓜花粉塊壁的解離效果都是最好的，5%的NaOH溶液次之，5% 的HCl 及 5%、10%的NaClO溶液的解離效果均較好，而蒸餾水、乙酸異戊酯溶液對牛角瓜花粉塊壁仍然沒有解離作用。因此，以10% 的NaOH溶液對牛角瓜花粉塊壁處理10 min的解離效果的最好。

表 2 不同濃度溶液對牛角瓜花粉塊壁的解離效果?Table 2 Dissociation degrees of C. gigantean pollinia block in different concentrations of solutions

表 3 不同培養溫度與培養時間對牛角瓜花粉萌發率及花粉管長度的影響?Table 3 Effect of different culture temperature and time on pollen germination rate and pollen tube length in C. gigantean

2.2 不同培養條件對牛角瓜花粉萌發和花粉管生長的影響

采用10%蔗糖＋0.1%硼酸＋5 mg/L氯化鈣＋15 mg/L 6-BA的培養基，在不同溫度（25、30、35、40 ℃）下分別培養 1、2、3、6、12 h，就不同培養溫度與培養時間對牛角瓜花粉萌發率及花粉管長度的影響情況進行了試驗，結果如表3。表3表明：當培養溫度為25 ℃時，花粉生長較為緩慢，培養0～12 h花粉的萌發率一直處于升高狀態，花粉管長度也一直處于增加狀態，但萌發率及花粉管長度均較低，培養12 h花粉的萌發率為57.97%，花粉管長度為8.68 mm。當培養溫度為30 ℃時，花粉生長良好，培養0～6 h花粉萌發率顯著升高，花粉管長度也增長得很快，培養6 h和培養12 h的花粉萌發率基本一致，說明花粉在培養溫度為30 ℃、培養時間為6 h的萌發率已經達到最高值；花粉管長度在培養6～12 h時的增長速率也顯著減緩，在培養12 h時花粉萌發率為80.04%，花粉管長度為9.82 mm。在培養0～6 h這個時間段花粉萌發率升高很快，花粉管長度增加也較快，而培養6～12 h花粉萌發率的升高變得緩慢，花粉管長度的增加也變得緩慢；在培養12 h時花粉萌發率達到75.99%，花粉管長度為9.72 mm，同時有部分花粉的內含物溢出（如圖1 C所示）。由此可見，在培養12 h 時，培養溫度為35 ℃的花粉萌發率和花粉管長度比培養溫度為30 ℃時的都要低，說明35 ℃的培養溫度對花粉的生長起到了一定的抑制作用。當培養溫度為40 ℃時，花粉生長明顯受到抑制，在培養12 h時花粉萌發率為2.61%，花粉管長度為1.24 mm，同時花粉中的內含物溢出，40 ℃的培養溫度已超過促使牛角瓜花粉萌發的適宜溫度，這一培養溫度可使花粉失活。由此證明，牛角瓜花粉萌發的最適培養溫度為30 ℃。

圖 1 牛角瓜花粉離體萌發狀態Fig. 1 Germination in vitro status of C. gigantean pollens

圖2 不同培養溫度與培養時間下牛角瓜花粉萌發率和花粉管長度的變化曲線Fig. 2 Change curves of pollen germination rate and pollen tube length in C. gigantean at different culture temperatures and time

不同培養溫度與培養時間下牛角瓜花粉萌發率和花粉管長度的變化曲線如圖2所示。由圖2可知，在培養1～2 h內，35 ℃下花粉萌發率的升高最快，且花粉管長度的增長速率最快；在培養2～3 h內，30 ℃下花粉萌發率的升高速度最快，35 ℃下花粉管長度的增長速率最快；在培養3～6、6～12 h這兩個時間段內，25、30、35 ℃下牛角瓜的花粉萌發率和花粉管長度的增長速度都顯著降低，40 ℃時牛角瓜的花粉大部分失活，花粉萌發率及花粉管長度都顯著低于其它溫度條件下的。在25、30、35 ℃下，花粉萌發的持續時間分別為12、6、12 h，其最高萌發率分別為57.97%、80.05%、75.99%，花粉管長度最大值均出現在培養12 h時，分別為8.68、9.82、9.72 mm。花粉在30、35℃的溫度條件下培養6 h后其萌發率趨于穩定，花粉管長度比較適中，已能表現出牛角瓜花粉萌發的狀態，因此，牛角瓜花粉萌發的最佳培養溫度為30 ℃，最佳培養時間為6 h。

2.3 不同培養基對牛角瓜花粉萌發率和花粉管長度的影響

將裝有花粉塊的培養基在30℃的條件下暗培養6 h后置于光學顯微鏡下觀察計數，不同培養基處理組合下牛角瓜花粉的平均萌發率及花粉管長度見表4。由表4可知，A3B2處理組合的花粉萌發率最高，達到94.77%，與其它各處理組合間的差異極顯著；A3B3處理組合的花粉管長度最長，為11.87 mm，與處理A3B1組合間的差異顯著，與其它各處理組合間的差異極顯著；而處理A1B3組合的花粉萌發率及花粉管長度均最低，花粉萌發率為12.43%，與其他各處理間呈極顯著差異，花粉管長度為6.44 mm，與處理A1B1間呈顯著差異，與其他各處理間呈極顯著差異。在整個試驗過程中，沒有發現花粉管生長畸形的現象。

表 4 不同培養基處理組合間牛角瓜花粉萌發率和花粉管長度鄧肯多重比較(LSR)?Table 4 Dancun multiple comparisons of pollen germination rates and pollen tube lengthes in C. gigantean between different medium treatment combinations

2.4 蔗糖、硼酸的不同質量濃度對牛角瓜花粉離體萌發的影響

對牛角瓜花粉離體萌發試驗結果進行方差分析，結果見表5。由表5 可知，蔗糖濃度不僅對牛角瓜花粉萌發率的影響達到極顯著水平，而且對其花粉管長度生長的影響也達到了極顯著水平；硼酸質量濃度則只對花粉萌發率的影響達到極顯著水平，而對花粉管長度生長的影響卻不顯著。由此說明，蔗糖和硼酸的質量濃度對花粉萌發率均有重要影響，蔗糖對花粉管生長具有重要影響，而硼酸對花粉管生長的影響卻不大。

表 5 牛角瓜花粉離體萌發試驗結果的方差分析?Table 5 Variance analysis of germination in vitro result of C. gigantean pollens

對牛角瓜花粉離體萌發試驗結果進行極差分析，結果見表6。由表6 可知，參試培養基中的兩種元素對牛角瓜花粉萌發率和花粉管長度影響的主次順序為：蔗糖＞硼酸。由此可以看出，培養基中的蔗糖濃度對花粉萌發率和花粉管長度的影響最大，而硼酸質量濃度的影響較小。根據蔗糖和硼酸極差值的大小可以得出，蔗糖濃度水平對牛角瓜花粉萌發率和花粉管長度的影響的大小次序是：K3＞K2＞K1。硼酸濃度水平對牛角瓜花粉萌發率和花粉管長度的影響的大小次序是：K2＞K3＞K1。文中的K表示不同濃度水平，K3表示高濃度水平，K2表示中等濃度水平，K1表示低濃度水平。由此得出，最適合牛角瓜花粉萌發的處理組合是A3B2，即20%蔗糖＋0.1%硼酸。

表 6 蔗糖和硼酸對牛角瓜花粉離體萌發影響的極差分析?Table 6 Rang analysis of effect result of sucrose and boric acid on germination in vitro of C. gigantean pollens

3 結論與討論

牛角瓜的花粉是由一層薄膜包裹形成的花粉塊，這層薄膜能使花粉塊較長時間地保持活力，并能使花粉塊擴散到更遠的地方，因此，牛角瓜花粉粒外面這層薄膜即花粉塊壁在自然條件下有利于花粉的傳播，但在牛角瓜花粉離體萌發的試驗中，花粉萌發后需要去除花粉塊壁以方便統計花粉萌發數以及測量花粉管長度。本研究結果表明，將花粉塊壁放在10%的NaOH溶液中處理10 min，這樣最容易剝離。

花粉離體萌發需要特定的培養條件，如培養溫度、培養時間、培養基及其pH值等。每種植物花粉的萌發和花粉管的生長都有自己最適的溫度。如薄殼山核桃[9]花粉離體萌發和花粉管生長的最適溫度為25 ℃，光皮樺[10]、桔梗[11]花粉離體萌發最適培養溫度為30 ℃，魔芋[12]花粉的適宜培養溫度為26～28 ℃。筆者研究結果顯示，牛角瓜花粉萌發的最佳溫度為30 ℃，最佳培養時間為6 h。可見，對于不同樹種而言，其適宜的花粉離體萌發溫度存在差異，應根據具體樹種選擇適宜的培養條件。培養溫度和培養時間對牛角瓜花粉離體萌發和花粉管生長均有顯著的影響，花粉萌發率和花粉管長度隨著培養溫度的升高均表現出先增加后降低的變化趨勢，這與蒲光蘭等人[6]對麻瘋樹花粉離體萌發的試驗結果一致。培養基的pH值對牛角瓜花粉離體萌發的影響還有待于進一步的研究。

花粉離體萌發所需培養基的成分主要是蔗糖和硼酸[13-14]。大多數研究者的研究結果[9,15-16]均表明，蔗糖是許多植物花粉離體培養所必需的重要營養成分。蔗糖不僅能夠為花粉萌發和花粉管生長提供營養物質，也能夠提供花粉萌發所需的滲透壓[17]。研究中發現，蔗糖濃度對牛角瓜的花粉萌發及花粉管生長均有極顯著的影響，當其質量濃度達到20% 時，其對牛角瓜花粉萌發的效果最佳。適宜的蔗糖濃度能促進牛角瓜花粉的萌發，隨著蔗糖添加量的加大，花粉萌發率逐漸上升，這與李貴榮等人[18]研究的火焰無核葡萄花粉離體萌發試驗結果一致。但蔗糖濃度應控制在一定范圍內，濃度過低則花粉壁易破裂，而濃度過高又會造成代謝物堆積抑制萌發，王改萍等人[19]在對楸樹等4種梓屬樹種的花粉離體培養中發現，蔗糖濃度過高則對花粉萌發率及花粉管生長均有一定的抑制作用。所以，培養基中蔗糖的質量濃度不能過高，過高會出現質壁分離現象。在本次試驗中未發現質壁分離的現象，說明蔗糖的質量濃度設置較合理。

缺硼可以導致花粉管破裂[20]。在自然條件下，花粉中硼素的質量濃度是不足的，這種不足可通過較高質量濃度的柱頭和花柱內的硼酸來補償[21]。而在離體培養條件下，適宜的硼酸處理能有效提高花粉的萌發率，促進花粉管生長[10,22-23]。硼酸的質量濃度對牛角瓜的花粉萌發具有極顯著的影響，而其對花粉管生長的影響卻不顯著，當硼酸的質量濃度為0.1%時，其對牛角瓜花粉萌發的效果最好，花粉萌發率和花粉管長度顯著高于其他兩個處理水平的；當其質量濃度達到0.2%時，硼酸對牛角瓜花粉萌發產生了一定的抑制作用，但對花粉管生長卻最好。這一結果說明，一定質量濃度的硼酸能夠促進牛角瓜花粉的萌發和花粉管的生長，超過一定質量濃度反而會起到抑制作用，這與何春燕等人[24]研究的7種油茶花粉萌發的試驗結果相一致。

綜上所述，牛角瓜花粉萌發和花粉管生長的最適培養基為20%蔗糖＋0.1%硼酸＋5 mg/L氯化鈣＋15 mg/L 6-BA。在此培養基上，并在30 ℃的溫度條件下培養6 h，其花粉萌發率達到94.77%，花粉管長度為11.07 mm。參考文獻：

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Germinationin vitroofCalotropis giganteanpollens

LIU Peng, ZHANG Tai-kui, WANG Lian-chun, ZHENG Yuan, YE Wei-yan, LIU Hui-min
(Forestry College, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China)

In order to research the optimal conditions and medium ingredients for germinationin vitroofCalotropis giganteanpollen, taking fresh pollens in two-year old plants as materials, the effects of different solutions on dissociation degree of pollinia block were studied. The effects of culture temperature, culture time, and medium ingredients on pollen germination rate and pollen tube growth inC. giganteanwere researched by usingin vitroculture method. The results showed that: The best dissociation degree was achieved in the treatment of pollinia soaked in 10% NaOH for 10 minutes.The optimum temperature for pollen germinationin vitrowas 30 ℃, and germination rate was stable after cultured 6 hours and pollen tube grew well after cultured 12 hours at the temperature. The effects of sucrose on pollen germination rate and pollen tube length were greater than boric acid. The pollen germination rate reached 94.77% and the pollen tube length was 11.07 mm after 6 hours cultured on the optimal culture medium supplemented with 20% sucrose, 0.1% boric acid, 5 mg/L calcium chloride and 15 mg/L 6-BA at 30 ℃.

Calotropis gigantean; pollinia block; pollen germination; pollen tube growth;in vitroculture

S661.9

A

1003—8981(2015)02—0142—07

2014-12-15

林業公益性行業科研專項（201304810）。

劉 鵬，碩士研究生。

劉惠民，教授，博士。E-mail：hmliu@swfu.edu.cn

劉 鵬,張太奎,王連春,等.牛角瓜花粉離體萌發研究[J].經濟林研究,2015,33(2):142－148.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.025

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文編校：伍敏濤]