分子生物學技術在水環境微生物研究中的應用

李博偉　酈和生

摘要：簡述了核酸雜交技術、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增技術、分子指紋技術和克隆基因文庫技術4種分子生物學技術，綜述了4種技術在海洋、湖泊、河流和其它水生態系統中微生物多樣性的研究進展，研究內容大致可分為三個方向：一是人類活動對水環境微生物多樣性的影響；二是種群結構和污染之間的規律；三是菌株的篩選和利用，使人們可以在水環境保護、治理過程中變得更加高效、有的放矢。

關鍵詞：分子生物學技術；水環境；微生物多樣性

中圖分類號：TU528.59 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2014）04-0224-03

1、引言

分子生物學技術為我們研究微生物的多樣性、菌種鑒定和定量分析提供了全新的技術手段，其高速的發展大大提高了我們對復雜微生物體系的分析能力，使我們能夠在環境體系與微生物之間建立起一種對應關系。近年來研究人員根據每種技術的特點，在不斷完善分析方法的基礎上努力降低其分析局限性，使分子生物學技術在水環境微生物多樣性研究中的應用領域取得了巨大的進步。微生物作為生態系統中的分解者，在水體修復和自凈過程中的作用極為關鍵，但同時，當環境惡化時我們也可以看到水華、赤潮等現象背后微生物在從中作祟，由此可見，微生物在環境保持和治理過程中存在兩面性，人們賴以生存的水環境與微生物之間存在著微妙的關系，相互依存互相影響。本文綜述了近年來應用于各種水環境下微生物多樣性的分子生物技術，通過研究人們可以在水環境保護、治理過程中變得更加高效、有的放矢。

2、分子生物學技術

分子生物學是研究細胞的物理、化學的性質和變化以及這些性質和變化與生命現象之間關系的學科，利用遺傳信息的傳遞，基因的結構、復制、轉錄、翻譯、表達調控和表達產物的生理功能，以及細胞信號的轉導等對微生物進行解析。20世紀70年代末至90年代初，基于不同的機理涌現出了大量的分子生物學技術，其中用于研究水環境微生物種群的技術大致可以分為4類：核酸雜交技術，聚合酶鏈式反應（PCR）擴增技術，分子指紋技術和克隆基因文庫技術。

核酸雜交技術的發展起源于20世紀70年代，基于核酸堿基互補配對的原理，用特異性的探針與待測樣品的DNA或RNA形成雜交分子的過程。衍生技術：Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、原位雜交（ISH）、熒光原位雜交（FISH）、芯片技術等。

PCR擴增技術的發展起源于20世紀80年代末，其原理為基于目標基因設計一對引物，以目標基因為模板精確地擴增核酸序列。PCR擴增技術的發明對分子生物學技術產生了重大影響，1993年Kary Mullis因在該領域做出的巨大貢獻曾獲得了當年的諾貝爾化學獎，隨后PCR衍生技術大量出現，包括：定量/實時PCR（Q/RT-PCR）、巢式PCR、逆轉錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、競爭PCR等。

分子指紋技術的產生基于PCR擴增技術，是目前應用于水環境微生物研究的最流行的分析方法，其原理為將代表微生物群落結構的核酸分子進行各種形式的凝膠電泳，從而將代表微生物群落中各種不同種群的核酸分子區分開。包括：隨機引物DNA多態性擴增（RAPD）、擴增（DNA）限制性酶切片段分析（ARDRA）、單鏈構象多態性分析（SSCP）、梯度凝膠電泳技術（DGGE/TGGE）、核糖體基因間隙分析（RISA）、限制性長度多態性分析（RFLP）等技術。

克隆基因文庫為匯集著基因組所有DNA序列的重組體DNA群體，可以提供精確的微生物分類信息，常用于菌種鑒定，但建庫過程費時費力。

3、水環境中微生物多樣性的研究

3.1 海洋中微生物種群結構的研究

研究內容大致可分為三個方向：一是人類活動特別是養殖業對海洋微生物多樣性的影響；二是赤潮時種群結構的變化；三是海洋菌株的利用。

海洋是地球上最大的天然水體生態系統，已越來越受到人類活動的影響，宋志剛等以中國東海海洋微生物為研究對象，通過PCR-ARDRA技術進行多樣性分析，研究發現東海海洋微生物無論是菌種還是菌株層面都具有較高的多樣性，微生物種類和數量繁多。隨著人類海水養殖規模的擴大、污水排放量的增加及旅游產業的發展，海洋尤其是近海沿岸所承受的環境壓力逐年增加，人類活動引發的污染直接導致了大陸周邊海洋環境中微生物結構和種群的變化，其中養殖業帶來的富營養化作用明顯。李佳霖等采用T-RFLP和DGGE技術對大連長山群島海岸潮間帶沉積物中的微生物群落結構進行分析，并通過16S rRNA克隆文庫解析微生物群落結構，研究表明，地理位置相近的旅游區與養殖區沉積物中微生物種群結構差異顯著，養殖區的微生物群落結構、豐度、香農指數和均勻度均較高，優勢微生物為變性細菌、浮霉菌、擬桿菌、放線菌等多個功能類群，其中的紅細菌目以及共生的浮霉菌和擬桿菌與赤潮發生直接關聯。

由于赤潮、水華等環境惡性事件頻發使得人們對海洋微生物的研究越發重視，Laura B.Fandino等曾通過DGGE和1 6S rDNA測序技術在南加利福尼亞沿岸發生甲藻水華期間對微生物種群結構的變化進行了研究，研究表明，微生物的種群組成和代謝與海洋中的富營養化狀態變化緊密相連，水華中游離與附著菌群存在顯著不同，游離細菌占細菌總數的90%以上，16SrDNA克隆分析的24個結果中7種為類Cytophaga菌屬，6種屬于變形菌門a亞綱，5種屬于變形菌門γ亞綱，其中一些類Cytophaga菌屬在降解海水中高分子有機物的過程中發揮了重要作用。

海洋中有大量的特殊微生物未為人類熟知，蘊藏著巨大的生物資源，海洋微生物的研究將為開發利用海洋微生物資源提供重要的參考依據。信艷娟等采集大連灣原油污染海域的海水、海泥和海綿樣品，以原油作為唯一碳源分離培養，經16S rRNA克隆文庫分析，共獲得22個屬的50株菌，其中45株具有石油降解性能。近年來新一代的基于大規模DNA序列的方法——GeoChip被廣泛應用于海洋微生物群落結構、功能以及微生物群落在生態系統中發揮的功能等研究中。endprint

3.2 河流中微生物種群結構的研究

河流沿岸是人類活動最密集的地區之一，政府對人類活動產生的污水排放及其對河流的影響進行了長期的監控，排污口微生物樣本的分析對環境評價具有重要的指導意義，Hidetoshi Urakawa等對運河市政污水排放口的沉積物中的氨氧化細菌的豐度和種群結構進行了研究，分別采用實時定量PCR技術和免疫熒光染色技術，其克隆分析和限制酶分析得到了相似的結果，即在此區域的優勢菌種是Nitrosomonas，與其它區域相比該區域缺乏微生物種群的多樣性。在水處理落后地區，河流極容易受到人類和動物的糞便污染，其中的腸道病菌會直接威脅人類身體健康，將分子生物技術用于病原體的檢測也是分子生物技術的一項重要作用，與傳統技術相比具有重大優勢，Anouk Martellini等首次采用線粒體DNA序列作為標記引物經單PCR、多重PCR和套嵌PCR分析生活污水、農業徑流、養豬場污水和兩條被污染河流中的微生物種群，通過基因標記的識別可以快速找出糞便污染源。E.T.Lagally等發明了一種包含PCR擴增、毛細管電泳分析并集成了電子控制和熒光檢測的便攜式裝置，并通過該裝置實現快速高效檢測大腸桿菌和金黃葡萄球菌。

3.3 湖泊中微生物種群結構的研究

湖泊微生物的多樣性研究，有助于人們更為深入地掌握湖泊微生物的分布特征及其在湖泊生態系統中的功能與作用，對深入開展湖泊生態環境研究具有重要的意義。趙興青等應用PCR-DOGE對南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置不同位點的表層沉積物微生物群落結構進行研究比較，結果顯示同一湖泊不同采樣點DGGE圖譜的差異性不大而不同湖泊微生物DGGE條帶數目和位置具有明顯差異，羅明等采用ARDRA研究羅布泊嗜鹽細菌的群落結構和多樣性，Halomonas為優勢菌群，Chromohalobacter、Halobacillus為次優勢菌群。采用ERIC-PCR分析優勢菌群Halomonas各菌株的基因組特征，顯示出有21種指紋圖譜。研究結果揭示，羅布泊嗜鹽細菌不僅具有豐富的多樣性，還蘊藏著具有地域特點的新菌種資源。湖泊極易受到人類活動的影響產生富營養化問題，隨之出現的水華會嚴重影響湖泊的生態功能與水環境質量。劉慶等在富營養化嚴重的滇池、巢湖和太湖各選取4個采樣點，采用16S～23S rRNA之間的ITS序列作為標記引物，通過T-RFLP分析藍藻種群結構和多樣性，發現藍藻與電導率、pH值、總有機碳和正磷酸鹽有顯著相關性。湖泊生態系統微生物在有機物代謝特別是氮磷循環中起著至關重要的作用。

3.4 其他類型水體中微生物種群結構的研究

污水伴隨著人類活動而產生，其在水環境總量的占比雖然不大，但其對水環境生態系統的影響卻變得越來越大。眾所周知，生物處理是污水處理過程中的關鍵步驟，微生物的種群結構多樣性與污水處理效果息息相關。Nico Boon等使用16S rRNA作引物，結合DGGE技術和統計學方法分析生活污水、造紙廠等高含碳的工業廢水、食品廠等富含脂類物質的工業廢水以及紡織廠工業廢水的活性污泥中微生物菌群結構，該研究表明，通過DGGE和16S rRNA技術不僅可以用于比較微生物群落間的差異同樣可以作為一種工具用于改善污水處理過程中的監測和控制，改進處理不同種類廢水的活性污泥工藝。人工濕地作為一種污水有效凈化手段其微生物多樣性的研究正變得越來越深入，Bing Xie等利用SSCP圖譜分析上海夢清園蘆葦人工濕地進出口微生物的多樣性，得出異養菌、硝化細菌和反硝化細菌各個季節的分布不一，微生物功能群的分布與濕地中不同營養水平有關。地下水是水環境生態系統中的一部分，正面臨著進一步污染的威脅，田揚捷等運用RISA法對垃圾填埋場地下水生態系統中微生物的空間異質性進行定量分析，分析表明：細菌群落在空間上的差異顯著大于隨時間產生的變化，不同位置和深度的地下水RISA圖譜存在明顯差異，當垃圾滲瀝液向地下環境擴散時，將會獲得更多的機會接觸到具有對應降解能力的合適細菌。

4、結語

隨著分子生物學技術的不斷發展，其在水環境領域的地位已變得越來越重要。研究表明，將分子生物學的定量和定性技術結合可以很好地表征微生物群落結構特征，揭示水體污染狀況與特征微生物之間的關系，為治理和提高處理效果提供依據；簡化分析步驟并將其用于水體監測領域且與其它監測手段配合使用，可以為水環境監測提供可靠的技術支持。水環境中微生物種群結構多樣性、生存狀態及功能特點信息的獲得將大大提高水環境治理能力，并為制定改善環境、修復水土的發展決策提供有力的科學依據。endprint