對苯酚氯仿法和鹽析法提取DNA的歸納

2015-01-07 23:27:49姜海霞

中學生物學 2014年5期

姜海霞

提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學方法分離具有不同理化性質(zhì)的生物大分子。對于DNA的提取而言，就是要利用DNA與RNA、多糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物化性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。苯酚氯仿法和鹽析法是高中生物提取DNA的兩種常規(guī)方法，下面對苯酚氯仿法和鹽析法提取DNA的原理、注意事項、常見問題與對策等進行了歸納分析。

1.兩種提取DNA的原理理解

1.1苯酚氯仿法原理

苯酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復抽提，可使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。SDS能將細胞膜裂解，在EDTA、蛋白酶K的存在下消化蛋白質(zhì)分子，使核蛋白變性降解，從而使DNA從核蛋白中游離出來。蛋白質(zhì)表面帶有親水基團，容易進行水合作用，使蛋白質(zhì)分子能進入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當有機溶液存在時，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。

1.2鹽析法原理

DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl的濃度變化而改變：在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時，DNA溶解度最小；當NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時，DNA的溶解度又逐漸增大。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？這是因為用高濃度的鹽溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；而用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。

2.兩種提取DNA的注意事項

兩種提取DNA的大體方法均是：材料準備→破碎細胞，釋放內(nèi)容物→核酸分離、純化→沉淀或吸附核酸并去除雜質(zhì)→核酸溶解在適量緩沖液或水中。其中注意的事項歸納如下：

材料準備：最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融；提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）；組織培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解；含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集。

細胞裂解：針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀夥绞剑海?）對植物材料采用液氮研磨；（2）對動物組織采用勻漿或液氮研磨；（3）組織培養(yǎng)細胞時加人蛋白酶K；（4）在細菌中加入溶菌酶破壁；（5）在酵母菌中加入破壁酶。

核酸分離、純化：采用苯酚氯仿抽提時應充分混勻，但動作要輕柔，離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間。針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質(zhì)的方法。（1）蛋白質(zhì)的去除：①酚/氯仿抽提；②使用SDS；③高鹽洗滌；④蛋白酶處理。（2）多糖的去除：①高鹽法，高鹽可溶解多糖；②用多糖水解酶將多糖降解；③在提取緩沖液中加一定量的氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。（3）多酚的去除：①在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、半胱氨酸等；②加入易與酚類結合的試劑：如PVP、PEGf聚乙二醇），它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結合。（4）鹽離子的去除：70%的乙醇洗滌。

核酸沉淀、溶解：當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分。沉淀時加入1/10體積的NaAc，有利于充分沉淀。沉淀后應用70%的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。若長期儲存DNA建議使用TE緩沖液溶解，TE中的EDTA能螯和Mg²⁺或Mn²⁺離子，抑制DNase。

3.DNA提取常見問題與對策

（1）DNA樣品不純的原因及對策：

①DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)，可采用重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)。

②DNA在溶解前，有酒精殘留，可采用重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)。

③DNA中殘留有金屬離子，可采用增加70%乙醇洗滌的次數(shù)（2～3次）。

（2）DNA降解的原因及對策：

①材料不新鮮或反復凍融，可采用盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融。

②未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性，可采用液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液；在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量。

③提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷，細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔。

④外源核酸酶污染，可采用所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌。

⑤反復凍融，可采用將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融。