何首烏飲對衰老大鼠腎臟C D 2 6表達的影響

趙榮慧 鄭立雙 馬連順 牛嗣云

（1.河北大學附屬醫院臨床藥學室，河北 保定 071000；2.河北大學附屬醫院中心實驗室，河北 保定071000；3.河北大學基礎醫學院，河北 保定 071000）

隨著經濟社會的持續發展，人類壽命不斷延長，社會老齡化問題日益加劇[1]。到2020年，我國老年人口將達到2.5億[2]。自40歲開始，人類腎臟開始衰老[3]。伴隨著腎臟重量減少，功能健全的腎小球逐漸減少。流行病學調查顯示，慢性腎臟疾病(CKD)患病率隨增齡而大幅度增加[4]。

何首烏飲是祖國醫學的奇葩。具有保護腎臟，延緩衰老作用[5]。面對衰老帶來的諸多社會醫學問題，開展老年醫學研究，探討何首烏飲延緩衰老機制，對臨床有一定的指導意義。

CD26是白細胞分化抗原之一，具有獨特的二肽基肽酶IV活性，可以分解N端第2位脯氨酸的多肽物質生成一段兩肽[6]。CD26對含有脯氨酸的多肽在腎臟的轉運以及腸道中的消化過程中起著重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

體重200-220g雄性Wistar大鼠30只(由河北醫科大學實驗動物學部提供)12月齡大鼠10只，18月齡大鼠20只。

1.2 何首烏飲方劑組成

何首烏（炙）、肉蓯蓉、懷牛膝、淫羊藿、丹參、茯苓按質量比3：2：3：2：5：3 比例混合，水浸泡 1 小時，水煎 2 次，30 分鐘/次,過濾后濃縮至含生藥 4.8g*ml-1，4℃保存，給藥前復溫至 25-30℃[7－8]。

1.3 主要實驗試劑

兔抗鼠CD26一抗，SABC(兔IgG)-POD Kit試劑盒，恒溫箱。

1.4 實驗方法

30只大鼠適應性飼養1周后分組，10只12月齡大鼠作為青年對照組，20只18月齡大鼠按隨機數字表法分為自然衰老模型組和何首烏飲干預組。全程給予普通飲食，何首烏飲干預組第二天開始每天給予何首烏飲1ml/100g灌胃，自然衰老模型組給予等量生理鹽水灌胃。共60天。實驗期間動物自由進食、飲水、活動。

1.5 標本收集

最后一次灌胃4小時后斷頭處死大鼠，取腎臟中性甲醛固定，常規脫水。

1.6 免疫組化法觀察CD26在腎臟分布

從4%中性甲醛中取出腎組織，經脫水機脫水后，包埋制成蠟塊，將蠟塊切成大約4um的切片以備用。切片經烤片30 min后經三次二甲苯和三次乙醇中脫蠟至水，3%過氧化氫室溫處理10分鐘，滅活過氧化氫酶，用PBS洗3次。熱修復抗原，將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）,微波爐加熱至沸騰后斷電，6分鐘后，反復此次操作。冷卻后 PBS(pH7.0)洗滌 3 次[9]。

比例稀釋，滴加稀釋的一抗37℃孵育1小時。PBS(pH7.2)洗滌3次,每次2分鐘。用稀釋滴加5%BSA封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體。用稀釋液將一抗按一定液將Bio-羊抗兔IgG濃縮液按1：100稀釋成工作液，滴加Bio-羊抗兔IgG工作液，37℃孵育30分鐘，PBS(pH7.2)洗滌3次,每次2分鐘。用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1：100稀釋成工作液，滴加SABC-POD工作液，37℃孵育30分鐘，PBS(pH7.2)洗滌 4 次,每次 5 分鐘。

DAB顯色，室溫顯色，鏡下控制反應時間，20分鐘后，蒸餾水洗滌終止反應。蘇木素復染。依次加稀鹽酸乙醇，稀氨水，水洗10分鐘。

脫水：80%乙醇2分鐘，90%乙醇2分鐘，95%乙醇3分鐘，無水乙醇5分鐘，無水乙醇5分鐘；二甲苯5分鐘2次。晾干。烤箱60℃2分鐘。滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片封片。

顯微鏡觀察。200倍光鏡下記錄每張切片陽性細胞數，每個標本隨機取5個視野將其陽性細胞的均數作為表達數[10]。

2 結果

（1）各組大鼠一般情況：青年對照組大鼠活潑，何首烏飲干預組大鼠毛色稍暗，活動可，自然衰老對照組大鼠毛色枯黃，懶動。

（2）免疫組化結果顯示：與青年對照組相比，CD26+T細胞在衰老對照組大鼠腎臟間質明顯聚集(P＜0.05)，在何首烏飲干預組聚集程度較衰老對照組明顯減少(P＜0.05)。

圖1

3 討論

CD26由二個同源亞單位組成，通過N端親水區粘附于細胞膜上。又稱二肽酰肽酶IV，是一種高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白，CD26是一種絲氨酸蛋白水解酶，可以在多肽的倒數第二個 L-脯氨酸或 L-丙氨酸處，切除N-末端的二肽。[11]

CD26的底物包括一大類含有脯氨酸的肽，如生長因子、趨化因子、神經肽及血管活性肽。CD26參與免疫調節、信號轉導及細胞凋亡，并在腫瘤的發展過程中發揮重要作用。[12]

腎間質是位于腎單位與集合管之間的結締組織，內含細胞纖維和基質部分，對腎血管起著支持作用[13]。有研究表明，CD26在糖尿病腎臟小鼠腎間質T細胞有明顯浸潤，它是T細胞活化的輔助分子，CD26分子的廣泛交聯能導致T細胞的直接激活。CD26以膜結合形式分布于多種細胞的Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有蛋白水解作用。CD26是一種多功能蛋白，是細胞膜受體和共刺激分子，參與機體的免疫調節、細胞凋亡、細胞黏附、等過程[12]。我們研究發現，在衰老大鼠腎臟間質，CD26高表達。在T細胞識別抗原過程中，CD26提供共刺激信號，輔助T細胞活化。

本研究證實CD26與CKD（慢性腎臟疾病）具有相關性，何首烏飲對衰老大鼠腎臟的干預可能通過抑制T淋巴細胞增殖減少CD26在腎間質的表達，從而起到保護腎臟，延緩衰老作用。

［1］陳香美，孫雪峰.共同參與有效防治老年腎臟病[J].中華醫學信息導報,2014-3-12,29(14).

［2］顧勇.老齡腎臟病的重要性和診治特點[J].老年醫學雜志,2011,17(5)：257-258.

［3］張望,MarcelloTonelli,Miguel Riella.慢性腎臟病與人口老齡化[J].中華腎臟病雜志,2014,2,30(2):81-84.

［4］王芳,王海燕.老年慢性腎臟病的防與治[J].中華醫學信息導報,2014-3-12,29(5):15.

［5］李文斌,崔美玉,許冬梅,關廣聚.二肽基肽酶IV活性對糖尿病腎病進展的影響[J].中華腎臟病雜志,2010,2,26(2):137-138.

［6］張志珍,毛積芳,劉智慧.二肽基肽酶IV的結構與功能[J].生命的化學,2001(5):381-383.

［7］陳俊香.衰老相關B-半乳糖苷酶在老年大鼠腎臟組織中的變化和意義[J].臨床醫學研究,2009,26(11):2022-2025.

［8］陳雪,牛嗣云.何首烏飲對衰老大鼠腎臟增殖與凋亡的影響[J].時珍國醫國藥,2009,20(3):650-651.

［9］耿廣琴,楊雅麗,王晶,黃勇.黨參水提物對D-半乳糖致衰老模型小鼠肝腎SOD活性、MDA含量及超微結構的影響[J].中醫研究,2014,27(7):70-74.

［10］馬鶴超,龐曉靜.何首烏飲對衰老大鼠腎臟TGF-β1和TIMP-1表達的影響[J].承德醫學院學報,2009,3(3):248-250.

［11］孫濤,李艷華.CD26與ADA結合活化腎癌細胞內TGF－β調控腎癌細胞遷移能力的研究[J].牡丹江醫學院學報,2013,34(3).

［12］姜祥品,郭紅巖.霉酚酸酯對糖尿病大鼠腎臟CD26表達的影響[J].中華腎病雜志,2014,30(8):592-597.

［13］王海燕.內科學[M].北京大學醫學出版社658.