楓香樹脂毒性及抑菌活性研究

陳朱輝，陳衛波，曾 韜*，沈徐標

1南京林業大學化學工程學院，南京 210037;2 南京大學醫學院，南京 210093

中國楓香(Liquidambar formosanaHance)是楓香屬中的一種，系金縷梅科楓香屬植物，分布于我國秦嶺及淮河以南各省，北起河南、山東，東至臺灣，西至四川、云南及西藏，南至廣東等地［1］。楓香樹干在受到外界的機械損傷，昆蟲及病原體的侵害等情況下可產生創傷性樹脂道［2］，從而分泌出楓香脂(oleoresin of Chinese sweetgum，簡稱楓脂)。楓脂是我國特產的天然樹脂和優良的藥化產品。曾韜等研究了“V”字形下降法割溝采集楓脂的方法［3］，為促進我國楓脂生產提供了理論基礎和實驗參考。楓脂經過加工分離后，可制成液體楓香精油和固體楓香樹脂［4］。吳維茜等［5］對楓香樹脂的水蒸汽蒸餾淺色化工藝進行了研究，生產出質量較高的楓香樹脂產品。楓香樹脂淡黃色、透明、質松脆，其主要成分有肉桂酸肉桂酯，肉桂酸冰片脂，五環三萜醇、酮、酸及它們的酯類化合物［6-8］。這些化合物具有抗肝炎、抗腫瘤、抗病毒、抗炎抑菌等多種藥理作用，是我國優良的傳統中藥材［9-11］。楓香樹脂是一種新型的天然藥化產品，目前正在開展相關應用研究，可望在藥品、食品和工業助劑等方面具有良好的應用前景［12，13］。

為開發楓香樹脂在食品、藥品、食品級膠粘劑及食品級印刷油墨等方面的應用，需要對楓香樹脂的相關生物活性和安全性進行評價。迄今，筆者尚未見有關楓香樹脂毒性和抑菌活性等方面的研究報道。為此，本研究進行了楓香樹脂對昆明小鼠的急性毒性和蓄積毒性和抑菌活性的實驗。

1 材料與儀器

1.1 供試材料、動物及菌種

楓香樹脂，廣西產楓脂，經水蒸氣蒸餾煉制［4］;六周齡雄性和雌性昆明小鼠［SCXK(蘇)2005-0002］，南京大學醫學院實驗室提供;大腸桿菌(Escherichia coli，ATCC 8739)、金黃色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus，ATCC25923)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，ATCC 6633)、假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens，ATCC 31554)、黑曲霉(Aspergillus niger，ATCC 10864)，供試菌種均由南京林業大學林產化工實驗室提供。

1.2 試劑

DMSO(分析純，南京化學試劑有限公司);蘇木精(阿拉丁試劑公司);伊紅(阿拉丁試劑公司);青霉素(哈藥集團制藥總廠);酮康唑(東京化成工業株式會社);丙酮(南京化學試劑有限公司)。

牛肉膏蛋白胨培養基(細菌用):牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，用氫氧化鈉調節pH 值為7。

土豆培養基(霉菌用):土豆(去皮切塊)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1000 mL，自然pH值。

1.3 儀器

JJ-500 型精密電子天平(美國雙杰兄弟有限公司);生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司);SP-300B 生化培養箱(南京恒裕設備有限公司);VS-1300L-U 超凈工作臺(蘇州安泰設備有限公司);D-1 型自動蒸汽壓力滅菌鍋(北京發恩設備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 毒性實驗

2.1.1 急性毒性實驗

取50 只小鼠按灌胃劑量隨機分為5 組，分別為DMSO 對照組，2 g/kg 體重，4 g/kg 體重，8 g/kg 體重和16 g/kg 體重組，每組10 只，雌、雄各半。實驗前小鼠禁食4 h，不禁水，對各劑量組進行灌胃針灌胃給藥，給藥后觀察并且記錄小鼠的外觀、行為、對刺激的反應、分泌物、排泄物和死亡情況，連續觀察14 d。對觀察期滿的小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟做組織切片，HE 染色后做病理學檢查。

2.1.2 胃排空實驗

選取10 只小鼠，以16 g/kg 體重的劑量進行灌胃給藥，實驗前小鼠禁食4 h，不禁水，給藥后每隔一段時間對一只小鼠進行解剖，觀察楓香樹脂在胃中的消化排空狀態，并稱量胃中殘留楓香樹脂的質量。

2.1.3 蓄積毒性實驗

選取16 只小鼠，實驗前小鼠禁食4 h，不禁水。分為實驗組和對照組，每組8 只小鼠，雌雄各半。實驗組給予5 g/kg 體重楓香樹脂灌胃，每周二與周五各灌胃一次，連續8 周，記錄小鼠的體重變化和行為改變。最后一次灌胃后一周處死小鼠，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟做病理學檢查。

2.2 抑菌活性測定

供試菌懸液的制備:在相對應的含有固體培養基的平板上，30 ℃的恒溫培養箱中，細菌活化24 h，真菌活化72 h。用無菌接種環挑取生長良好的菌落充分分散于無菌水中，調至濃度為106～107CFU/mL，備用。

含菌平板的制備:將配置好的培養基倒入100 mL 錐形瓶中，每瓶75 mL，滅菌后冷卻至50 ℃左右，在無菌工作臺上，在每個錐形瓶中加入15 mL 的菌懸液，混勻后趁熱向已滅菌的培養皿中倒入15 mL/皿培養基，冷卻后即為含菌平板。

抑菌活性測定:采用紙片法，用打孔器制得直徑為6 mm 的圓形濾紙片，滅菌后備用。配制濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078 mg/mL 的楓香樹脂溶液(溶劑為丙酮)。用無菌移液槍吸取10 μL 楓香樹脂溶液滴加在圓形濾紙片上，烘干后貼在含菌平板上，每個濃度做3 組平行實驗，每皿貼濾紙片6 片。用滴加丙酮溶液的濾紙片做陰性對照，用滴加濃度為0.1 mg/mL 的青霉素水溶液的濾紙片為細菌抑菌的陽性對照，用滴加濃度為0.1 mg/mL 的酮康唑丙酮溶液的濾紙片為真菌抑菌的陽性對照。在30 ℃的恒溫培養箱中，細菌培養24 h，真菌培養72 h。測量抑菌圈的直徑，結果取平均值。

3 結果與分析

3.1 毒性實驗

3.1.1 急性毒性實驗

小鼠灌胃給藥后，經14d 觀察，記錄小鼠的死亡情況，結果見下表1。

由表1 可知，所有劑量組的小鼠死亡率為0，無小鼠死亡。且14 d 內小鼠的外觀、行為、對刺激的反應、分泌物及排泄物無異常。取其主要臟器做病理學檢查中，小鼠的主要臟器組織切片的HE 染色結果見圖1。由圖1 可知，實驗組與對照組相比，細胞排列緊密，細胞膜完整，沒有炎癥反應和細胞壞死，并沒有明顯的病理學變化。由此可以確定給小鼠灌服16 g/kg 的楓香樹脂后，仍沒有出現中毒死亡，即可以認為楓香樹脂的LD50＞16 g/kg。按照毒理學的評價標準［14］，所用劑量顯著高于5g/kg 體重的無毒安全劑量，這表明楓香樹脂屬于實際無毒類物質。

表1 急性毒性實驗小鼠死亡率Table 1 Death rate of mouse in acute toxicity test

圖1 急性毒性實驗小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟石蠟切片HE 染色圖Fig.1 Paraffin sections HE staining of heart，liver，spleen，lung，kidney of mice in acute toxicity test

3.1.2 胃排空實驗

楓香樹脂的胃排空實驗是為了觀察楓香樹脂在小鼠胃中能否正常消化排空以及排空所需時間，以16 g/kg 體重的劑量灌胃后的排空結果如下圖2、3所示。

圖2 為小鼠腹部解剖圖，箭頭所指的是殘留楓香樹脂的位置，其中左圖是小鼠灌胃2 h 后的解剖圖，可見小鼠的胃中有楓香樹脂的殘留，且小鼠小腸中也開始出現楓香樹脂，說明楓香樹脂已經開始被消化排泄。右圖是小鼠灌胃16 h 后的腹部解剖圖，其中小鼠胃中已無楓香樹脂殘留，只有結腸中有小塊楓香樹脂殘留，說明楓香樹脂已完全排空。

圖2 小鼠腹部解剖圖Fig.2 Mouse abdominal anatomy

圖3 是小鼠胃內楓香樹脂殘留狀況，由圖中可以看出，隨著時間的延長，小鼠胃中殘留的楓香樹脂量越來越少。結合圖2 可知，在灌胃16 h 后，楓香樹脂完全排空。由此可以說明楓香樹脂在小鼠胃中會隨著時間慢慢消化排出，不會在胃中積留，可完全排空。

圖3 小鼠胃內楓香樹脂殘留狀況Fig.3 Residual properties of Chinese sweetgum resin in mice stomach

3.1.3 蓄積毒性實驗

經過9 周的實驗和觀察，兩組中所有小鼠均未出現死亡現象，小鼠的外觀、行為、對刺激的反應、分泌物及排泄物均無異常。在9 周的實驗期間，小鼠的體重變化見圖4 所示。

圖4 小鼠體重變化Fig.4 Changes of mice body weight

由圖4 可知，實驗組小鼠的體重與對照組小鼠無明顯差異，說明給小鼠灌服楓香樹脂并未影響小鼠的正常生長。主要臟器的組織切片HE 染色結果見圖5 所示，實驗組與對照組相比，實驗組各臟器細胞未出現明顯的空泡化，細胞排列緊密，細胞膜完整，未見細胞壞死，未見炎癥反應，并沒有明顯的病理學變化。可以說明楓香樹脂對小鼠無明顯的蓄積毒性作用。

圖5 蓄積毒性實驗小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟石蠟切片HE 染色圖Fig.5 Paraffin sections HE staining of the heart，liver，spleen，lung，kidney of mice in accumulative toxicity test

3.2 抑菌活性實驗

采用濾紙片法研究楓香樹脂的抑菌活性，其結果由表2 和圖6 可見，楓香樹脂對4 種細菌均有抑制作用，但對黑曲霉卻沒有抑菌效果。在4 種細菌中，對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的抑制作用較強，在10 mg/mL 濃度的抑菌圈直徑分別為20.3 mm 和18.6 mm，表明其對革蘭氏陽性菌有較好的抑制效果;對大腸桿菌和假單胞桿菌的抑制作用相對較弱，在10 mg/mL 濃度的抑菌圈直徑分別為12.4 mm 和13.1 mm，表明其對革蘭氏陰性菌的抑制效果較弱。

由表2 還可看出，隨著楓香樹脂的濃度降低，對細菌的抑制能力也隨之減弱，可知楓香樹脂對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、假單胞桿菌、枯草桿菌各受試菌的最小抑制濃度(MIC)分別是0.156、0.3125、0.625、0.3125 mg/mL。

表2 不同濃度的楓香樹脂的抑菌活性Table 2 Bacteriostatic activity of different concentrations of Chinese sweetgum resin

圖6 楓香樹脂對四種細菌的抑菌圈Fig.6 Inhibitory zone of Chinese sweetgum resin against 4 bacteria

4 討論與結論

急性毒性和蓄積毒性實驗是評價外源物質安全性的重要指標。急性毒性實驗是藥物毒理學安全性評價的第一步，具有了解受試物急性毒性強弱的作用。LD50是評價受試物急性毒性強弱以及比較其急性毒性大小的一個常用指標。LD50數值越大，則表明受試物急性毒性越弱、越小;反之，急性毒性就越強、越大。本實驗測定楓香樹脂對小鼠的LD50＞16 g/kg，根據毒理學評價標準［14］，楓香樹脂屬于實際無毒物質。

外源物質在機體內所產生的蓄積作用是引起亞慢性毒性作用和慢性毒性作用的基礎。人們在外源物質毒理學評定的實際工作中，可根據受試物的蓄積毒性強弱作為評估它的毒性作用指標之一，也是制定衛生標準時選用安全系數大小的重要參考依據。本實驗以5 g/kg 體重的劑量長時間給小鼠灌服后，未見小鼠出現死亡，與對照組相比，小鼠可以正常生長，平均體重的增加和重要臟器的病理學檢查均未見差異，說明楓香樹脂在小鼠體內無蓄積毒性。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌、枯草桿菌、黑曲霉等對食品衛生、臨床醫學和一些生物材料具有嚴重的危害和影響。楓香樹脂作為一種天然植物資源，對上述細菌都有不同程度的抑制作用，MIC 值分別為0.3125(大腸桿菌)、1.25(假單胞桿菌)、0.156 mg/mL(金黃色葡萄球菌)和0.3125 mg/mL(枯草芽孢桿菌)。

由上述實驗結果，可以初步判定楓香樹脂在相關藥、食產品方面的使用是安全的。本實驗研究為今后更進一步的毒理學研究及相關藥、食產品的開發應用提供了科學依據。

1 Zhang HD (張宏達).Flora of China (中國植物志).Beijing:Science Press，1979.55.

2 Zeng T (曾韜)，Song X (宋曉)，Zeng C (曾誠).Study on the methods of the tapping from Chinese sweet gum.China For Sci Tech(林業科技開發)，2010，24:84-87.

3 Zeng T (曾韜)，Song X (宋曉)，Zeng C (曾誠).A method of collection of oleoresin of Chinese sweetgum (一種采集楓香脂的方法).ZL201010617196.0.

4 Song X (宋曉)，Zeng T (曾韜).Study on process of steam distillation of Chinese sweetgum resin.Bio Chem Eng(生物質化學工程)，2010，44(6):10-13.

5 Wu WQ (吳維茜)，Song X (宋曉)，Zeng T (曾韜)，et al.Study on process of decolorization of Chinese sweetgum resin.China For Sci Tech(林業科技開發)，2013，27:105-107.

6 Yonkov LK，Ivanov CP，Fam TT，Comptes Rendus de Academie Bulgare des Sciences (Dakl.Bolg.Akad.Nauk.)1980，75:33.

7 Liu C (劉馳)，Xu JF (徐金富)，He QM (何其敏)，et al.Chemical components of theLiquidambar formosanaH.resin.Org Chem(有機化學)，1991，11:508-510.

8 Wu WQ (吳維茜).Study on technology of decolorization component analysis of Chinese sweetgum resin.Nanjing:Nanjing Forestry University (南京林業大學)，MSc.2013.

9 Shan JZ，Xuan YY，Zheng S，et al.Ursolic acid inhibits proliferation and induces apoptosis of HT-29 colon cancer cells by inhibiting the EGFR/MAPK pathway.Zhejiang Univ Sci B，2009 10:668-674.

10 Zhang PX，Li HM，Chen D，et al.Oleanolic acid induces apoptosis in human leukemia cells through caspase activa?tion and poly(ADP-ribose)polymerase cleavage.Acta Biochim Biophys Sin，2007，39:803-809.

11 Saraswati S，Agrawal SS，Alhaider AA，et al.Ursolic acid inhibits tumor angiogenesis and induces apoptosis through mitochondrial-dependent pathway in Ehrlich ascites carcinoma tumor.Chem-Biol Inter，2013，206:153-165.

12 Xing ZZ (邢珍珍)，Wu WQ (吳維茜)，Zeng T (曾韜).Tackifying effect of sweetgum resin in SIS hot melt adhesive.Chem Ind For Prod(林產化學與工業)，2014，34(2):51-55.

13 Xing ZZ (邢珍珍)，Chen ZH (陳朱輝)，Zeng T (曾韜).Study on preparation of Chinese sweetgum resin/ acrylate composite emulsion and properties of the pressure sensitive adhesive.J Fujian For Sci Tech(福建林業科技)，2014，41(3):94-99.

14 Shen JZ (沈建忠).Animal Toxicology (動物毒理學).Beijing:China Agriculture Publishing House，2002.83-102.