HLA-DR4 分子與抗類風濕性免疫活性肽構效關系的研究進展

呂翠翠，曹 慧，徐 斐

上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，發病率約占我國人口的0.35%～0.4%，其中致殘率可達15%，然而目前對RA 尚沒有一個較好的治療方法。最近在研究人類RA 的過程中，一些學者報道了口服免疫活性肽產生免疫耐受可使RA 的發病過程受到抑制，其機制為T 細胞對特異性肽段的識別作用。而有效的免疫耐受的激發依賴于:抗原遞呈細胞(Antigen Processing Cells，APCs)加工處理蛋白抗原成8～10 個氨基酸組成的抗原肽，并與其表面的HLA-DR4 分子形成HLA-DR4/肽復合物，供受體特異性T 細胞表面受體(TCR)所識別，進一步結合成TCR-HLA/DR4-抗原肽三分子復合體，T細胞被活化、增值并分泌各種免疫因子而啟動免疫應答［1］。

目前一些食源性免疫活性肽已經被制備或合成，并應用于RA 的預防和治療，但對其構效關系仍缺乏系統的研究。因此，本文從AntiJen 數據庫或相關文獻中查閱到和RA 有關的免疫活性肽，并對其與HLA-DR4 分子的構效關系進行了深入探討。

1 與RA 相關的免疫活性肽

免疫活性肽是一類具有促進淋巴細胞分化成熟、轉移免疫信息機及增強機體免疫機能等生物學功能的肽［2］。到目前為止，科研工作者已從乳蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、魚貝類蛋白、膠原蛋白等蛋白酶解物中分離出多種具有免疫活性的肽段。然而，與RA 相關的免疫活性肽的開發卻十分有限，不同來源的氨基酸組成及結構的免疫活性肽的IC50值差異也較大(見表1)。

表1 與RA 有關的免疫活性肽及活性值Table 1 Immunoactive peptides and the IC50values related to RA

2 HLA-DR4 分子的結構特征

HLA-DR4 分子由MHC II 基因群編碼，由于其最先在白細胞表面被發現且含量較高，所以稱為人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)。有足夠的證據發現和RA 有關的人類白細胞抗原主要為HLA-0401、0404、0405 等亞型，其中絕大部分為HLA-DR4* 0401［3，4］。Lanchbury［5-7］等通過研究不同地區RA 患病情況的結果表明HLA-DR4* 0401相對于其他等位基因，其致病的可能性更高，尤其是對嚴重關節炎患者，其92%～95% 的發病是由HLA-DR4* 0401 分子引起的。由于HLA-DR4 分子在人類免疫疾病中起重要作用，其結構已被廣泛研究。發現其分子晶體結構是由α 鏈和β 鏈以非共價鍵連接的異源二聚體，α 鏈由α1 和α2 結構域構成，β 鏈由β1 和β2 結構域構成，α1 和β1 結構域各含有1 個α 螺旋和4 個β 片層，它們形成了抗原肽結合槽(peptide-binding groove)，其中，α 螺旋為結合槽壁，β 片層為結合槽底［8］(見圖1)。該抗原結合槽的兩端是開口的，所以抗原肽在結合槽內可以向兩端伸展。抗原肽主要借助特定錨定殘基(anchor residue)駐扎在HLA-DR4 分子槽底部深淺不同的“口袋”(Pocket)中，其中，最重要的6 個口袋分別是Pocket 1、2、4、6、7、9(命名為P1、P2、P4、P6、P7、P9)(見圖2、圖3)［9］。這些Pockets 富含多態性氨基酸，且某一等位基因編碼的HLA-DR4 分子只能識別具有某一特定結構的一組抗原肽［10，11］。根據HLA-DR4 分子結構及CD4+T 細胞識別抗原肽序列的研究發現，HLA-DR4 分子的抗原結合槽一般可以容納長度為13 個氨基酸殘基的抗原肽，但能被CD4+T 細胞識別的抗原肽僅有9 個氨基酸殘基，這9 個氨基酸序列稱為核心結合序列(core binding sequence)，它在抗原肽與MHC II 類分子的特異性結合中起關鍵作用［12-14］。

圖1 HLA-DR4 的分子結構圖［10］Fig.1 Structural and molecular characteristics of HLA-DR4

圖2 HLA-DR4 分子的6 個主要抗原結合口袋［11］Fig.2 The peptide-binding groove of HLA-DR4

圖3 HLA-DR4 分子的抗原肽結合口袋［9］Fig.3 Antigenic peptide binding pocket of HLA-DR4

3 抗RA 免疫活性肽與HLA-DR 分子的作用機理

目前，已有學者對抗RA 免疫活性肽與其功能之間的關系進行了研究，發現抗RA 免疫活性肽氨基酸殘基的帶電性質、大小及疏水性等性質直接影響其與HLA-DR4 分子的結合［15-17］。因而，對抗RA免疫活性肽的性質與HLA-DR4 X 射線衍射晶體結構之間的關系進行深入探討，有助于更好的解釋其構效關系。

根據與RA 相關的免疫活性肽的氨基酸組成可見(表1)，其P-2 位置的氨基酸絕大部分為丙氨酸。Fugger［18］等研究證實P-2 位置的丙氨酸丟失可導致抗原肽與HLA-DR4 分子的結合能力損失6-7 倍，但對T 細胞的活化沒有影響。Dessen［9］等通過X 晶體射線研究表明該位置側鏈上的氫鍵對于TCR 與HLA-DR4 分子的結合起重要作用，這可能是由于側鏈形成的氫鍵容易從肽-HLA-DR4 結合物中突出延伸出來，從而有利于其結合。由此可見，P-2 位置上的丙氨酸可能主要起到結合HLA-DR4 分子的作用。P-1 和P3 位置的氨基酸絕大部分為甘氨酸。Fugger［18］等研究發現P-1 位置甘氨酸丟失可導致抗原肽與HLA-DR4 分子的結合能力損失40 倍，并會影響T 細胞的活化。P3 位置甘氨酸的作用與之類似，即側鏈形成的氫鍵從肽-HLA 結合物中突出延伸出來，使TCR 與HLA 分子結合的更緊密。Rosloniec［19］和Andersson［20］等研究還發現，在P3 位置用丙氨酸替代甘氨酸，可使抗原肽與HLA-DR4 分子的結合能力顯著增強。由此說明，此位置氨基酸殘基的立體特性與抗原肽的免疫活性密切相關，因而推測分子較小的甘氨酸殘基更適合此位置。

置于Pocket 1 中的P 1 位置的氨基酸絕大部分為苯丙氨酸，其次為亮氨酸和纈氨酸。這三種氨基酸都是疏水性氨基酸，具有疏水性側鏈。Andersson［20］等通過動物實驗研究發現P1 的苯丙氨酸被帶有芳香族側鏈的氨基酸，如酪氨酸取代對T 細胞的活化僅有微弱的影響。但P1 的苯丙氨酸(F)丟失對T 細胞的活化有顯著影響［18］。因為苯丙氨酸的疏水性側鏈易與Pocket 1 內壁上的氨基酸(多為β 鏈上的Gly86)相互作用形成疏水內核，提高了抗原肽與HLA-DR4 分子的親和力及形成復合物的穩定性，從而有利于抗原肽被MHC 分子遞呈到抗原遞呈細胞的表面［21］。HLA-DR4 分子的Pocket 1 為較深的疏水性口袋，主要由α 鏈上的殘基Ile7、Ile31、Phe32、Phe34、Trp43 及β 鏈上的殘基Val85、Gly86、Phe89 和Thr90 組成［12］。由此可見，P-1 位置氨基酸殘基的親水特征與抗原肽的免疫活性密切相關。

Hammer［22，23］等 研 究 發 現HLA-DR4 分 子 的Pocket 2 只接受帶負電的氨基酸，但從搜集的抗RA免疫活性肽的組成來看，出現在Pocket 2 中的多為帶正電的賴氨酸和精氨酸，這可能是由于HLA-DR4分子與抗原肽的結合不僅取決于氨基酸的帶電性質，還與其分子大小密切相關。Dessen［9］通過X-射線衍射獲得了HLA-DR4 的晶體結構，發現HLADR4 分子中的Pocket 2 比較深，只有長側鏈的氨基酸殘基才會被緊密的綁定到其結合槽中(見圖3)，從而有利于T 細胞受體識別。而賴氨酸和精氨酸的側鏈都比較長，符合Pocket 2 的特點。此外，精氨酸的側鏈可突出結合槽，使其更容易被T 細胞受體識別，而且精氨酸的胍基團所帶正電荷可以與HLADR4 分子Pocket 2 中Thr-β77 的氧原子形成氫鍵，從而增強其結合力。Edward［24］等研究也發現，P1的苯丙氨酸和P2 的賴氨酸對抗原肽與HLA 分子的結合至關重要，如果取代了這兩個位置的氨基酸，其結合力顯著下降。

Pocket 4 是由β 鏈第70 位至74 位一段高度保守的五氨基酸序列，即QKRAA 構成的一個肽錨定區域［25，26］。由于Pocket 4 底部β71 位置上的賴氨酸(K)或精氨酸(R)帶正電荷，因而推測其對抗原肽中帶負電荷的氨基酸殘基有較高的親和力，而帶正電荷的氨基酸殘基則抑制其結合。這與表1 中P4位置絕大部分為谷氨酸，其次是天冬氨酸是一致的。Fugger［18］的研究表明帶負電的谷氨酸的側鏈伸向槽內，和帶正電的Pocket 4 的肽結合槽的結合能力非常強，從而有利于T 細胞識別。同時，Dessen［9］等研究也發現，Pocket 4 適合側鏈比較大的氨基酸。20 種天然氨基酸中符合既帶負電又有較長側鏈的的氨基酸只有谷氨酸和天冬氨酸兩種，而谷氨酸的側鏈比天冬氨酸的長，所以P4 的谷氨酸對于抗原肽與MHC 分子的結合性起非常重要的作用。

Li 等［27-29］通過單個氨基酸替換代實驗和計算機模擬等方法證實P5 和P8 的氨基酸對HLA 分子與T 細胞受體的接觸起重要作用。由表1 可見，這兩個位置絕大多數的氨基酸分別是谷氨酰胺和賴氨酸，側鏈都較長，而HLA-DR4 分子P5 和P8 處的口袋都不深(見圖3)，由此推測該位置氨基酸長側鏈會突出肽-HLA-DR4 結合槽，從而有利于與TCR 相作用。Jardetzky［30］等通過晶體結構分析研究也發現T 細胞的活化需要抗原肽與HLA-DR4 分子在抗原呈遞細胞表面相接觸，有較長側鏈的氨基酸的一部分側鏈和TCR 相結合，而另一部分則包埋在HLADR4 分子的抗原結合槽口袋里。Fugger［18］等研究表明刪除了該位置的賴氨酸，對T 細胞的刺激性顯著降低。由此推測，P5 和P8 對HLA 分子與T 細胞受體的接觸也起重要作用。

Dessen［9］和Hammer［22］等通過研究發現，在HLA-DR4分子的α鏈上有兩個保守氨基酸，分別為Glu11 和Asp66，這兩個氨基酸在空間上彼此靠近并形成氫鍵，從而阻止Pocket 6 與帶電荷的氨基酸或長鏈氨基酸發生相互作用，因此Pocket 6 易于容納小體積、不帶電的或非長鏈的氨基酸殘基。此外，由圖3 也可看出，組成Pocket 6 的氨基酸形成了一個較淺的小口袋，這進一步說明此位置只適合側鏈較短的氨基酸。

結合于Pocket 7 中的氨基酸絕大部分為脯氨酸(見表1)Fugger［18］等研究表明如果剔除P7 的脯氨酸，HLA-DR4 分子與抗原肽的結合力及對T 細胞的刺激作用都明顯降低。Andersson［20］等研究也發現如果用丙氨酸替換P7 的脯氨酸會導致抗原肽與HLA-DR4 分子的結合能力降低5-10 倍。這可能是由于Pocket 7 比較淺但底部較寬(見圖3)，所以比較適合側鏈短且大的氨基酸，而脯氨酸正好符合此特點，這與Dessen［9］等研究的脯氨酸適合淺口袋的Pocket 7 是一致的。

由圖3 可看出，Pocket 9 非常淺，所以該位置只適合側鏈比較小的氨基酸。Dessen［9］等研究也表明分子很小的甘氨酸適合Pocket 9。Andersson［20］等的研究表明用帶極性的氨基酸替換P9 的甘氨酸后抗原肽與HLA-DR4 分子的結合能力增強5～10 倍，這有可能是因為Pocket 9 中HLA-DR4 分子的β57天冬氨酸可以和α76 精氨酸形成鹽橋，從而易于結合帶極性側鏈的氨基酸，比如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、絲氨酸等。

抗原結合槽一般容納13 個氨基酸的抗原肽，但能被T 細胞識別的抗原肽僅有9 個氨基酸，所以P10 和P11 的氨基酸對整個分子的結合力做出的貢獻非常小，由圖3 可見，這兩個位置的口袋非常淺，而與之結合的氨基酸側鏈又比較長，所以側鏈與結合槽的作用不一定緊密，該位置所提供的分子結合力很有限。Andersson［20］等的研究表明用丙氨酸替換P10 的谷氨酸后抗原肽與HLA-DR4 分子的結合能力增加，這證明了以上假說是成立的。

4 結論

本研究對抗類風濕性免疫活性肽與HLA-DR4分子的結合機制進行了深入探討。抗類風濕性免疫活性肽起主要免疫活性作用的9 個氨基酸核心結合序列為P1-P9，核心結合序列兩端的氨基酸對肽的結合性的影響很小。作為主要錨點的P1 位疏水性氨基酸和次要錨點的P6 位極性小分子可包埋在HLA-DR4 分子的結合槽中，因而對免疫活性肽與HLA-DR4 分子的結合尤為重要。而P2 位的帶正電荷氨基酸，P3 位的極性小分子，P4 位帶負，長側鏈的氨基酸以及P5 位帶長側鏈氨基酸主要負責其與HLA-DR4 分子的綁定，在這幾個位置的氨基酸側鏈會突出肽-HLA 分子結合槽，從而有利于TCR 的識別。P7、P8 和P9 位的口袋較淺，因而其與抗原肽氨基酸殘基的結合力相對較弱。

1 Song Z(宋哲).Application of PLS method in the T cell epitopes prediction.Dalian:Dalian University of Technology(大連理工大學)，PhD.2008.

2 Chen L (陳路)，et al.Bioactive peptide (or oligopeptide)feed additive:Research and applications.Acta Zoonutri Sin(動物營養學報)，2004，16(2):12-14.

3 Gonzalez Gay MA，et al.Influence of human leukocyte antigen-DRB1 on the susceptibility and severity of rheumatoid arthritis.Semin Arthritis Rheu，2002，31:355-360.

4 Goronzy JJ，et al.Prognostic markers of radiographic progression in early rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum，2004，50:43-54.

5 Lanchbury JS，et al.Strong primary selection for the Dw4 subtype of DR4 accounts for the HLA-DQw7 association with Felty's syndrome.Hum Immunol，1991，32:56-64.

6 Nepom GT，et al.MHC Class-II Molecules and Autoimmunity.Annu Rev Immunol，1991，9:493-525.

7 Ranges GE，et al.Prevention of type II collagen-induced arthritis by in vivo treatment with anti-L3T4.J Exp Med，1985，162:1105-1110.

8 Yu CY(于暢宇)，et al.Prediction of the cell epitopes based on ISC-SVR method.J Chem (化學學報)，2013，71:670-678.

9 Dessen A，et al.X-ray crystal structure of HLA-DR4 (DRA* 0101，DRB1* 0401)complexed with a peptide from human collagen II.Immunity，1997，7:473-481.

10 Ferrante A，et al.Cooperativity of hydrophobic anchor interactions:evidence for epitope selection by MHC class II as a folding process.J Immunol，2007，178:7181-7189.

11 Agudelo WA，et al.Quantum chemical analysis of MHC-peptide interactions for vaccine design.Mini-Rev Med Chem，2010，10:746-758.

12 Madden DR.The three-dimensional structure of peptide-MHC complexes.Annu Rev Immunol，1995，13:587-622.

13 Jardetzky TS，et al.Crystallographic analysis of endogenous peptides associated with HLA-DR1 suggests a common，polyproline II-like conformation for bound peptides.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:734-738.

14 Zhu Y，et al.Crystal structure of MHC class II I-Ab in complex with a human CLIP peptide:prediction of an I-Ab peptide-binding motif.J Mol Biol，2003，326:1157-1174.

15 Hammer J，et al.Precise prediction of major histocompatibility complex class II-peptide interaction based on peptide side chain scanning.J Exp Med，1994，180:2353-2358.

16 Marshall KW，et al.Prediction of peptide affinity to HLA DRB1* 0401.J Immunol，1995，154:5927-5933.

17 Southwood S，et al.Several common HLA-DR types share largely overlapping peptide binding repertoires.J Immunol，1998，160:3363-3373.

18 Fugger L，et al.Specificity of an HLA-DRBl* 0401-restricted T cell response to type II collagen.Eur J Immunol，1996，26:928-933.

19 Rosloniec EF，et al.HLA-DR1(DRB1* 0101)and DR4(DRB1* 0401)use the same anchor residues for binding an immunol dominant peptide derived from human type II collagen.J Immunol，2002，168:253-259.

20 Andersson EC，et al.Definition of MHC and T cell receptor contacts in the HLA-DR4 restricted immunodominant epitope in type II collagen and characterization of collagen-induced arthritis in HLA-DR4 and human CD4 transgenic mice.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95:7574-7579.

21 Falk K，et al.Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides elated from MHC molecules.Nature，1991，351:290-296.

22 Hammer J，et al.Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules:correlation with rheumatoid arthritis association.J Exp Med，1995，181:1847-1855.

23 Friede T，et al.Natural ligand motifs of closely related HLADR4 molecules predict features of rheumatoid arthritis associated peptides.Hum Immunol，1996，1316:85-101.

24 Edward F，et al.HLA-DR1 (DRB1～* 0101)and DR4(DRB1～* 0401)use the same anchor residues for binding and immunodominant peptide derived from human type II collegen.J Immunol，2002，168:253-259.

25 Jiang Z(蔣真)，et al.Review on the research and development of HLA-DRB1 alleles on RA.Chin J Rheumatol (中華風濕病學雜志)，2005，9:690-693.

26 du Montcel ST，et al.New classification of HLA-DRB1 alleles supports the shared epitope hypothesis of rheumatoid arthritis susceptibility.Arthritis Rheum，2005，52:1063-1068.

27 Li R，et al.Altered collagen II peptides inhibited T-cell activation in rheumatoid arthritis.Clin Immunol，2006，118:317-323.

28 Zhou Q，et al.Inhibition of T-cell activation with HLA-DR1/DR4 restricted non-T-cell stimulation peptides.Hum Immunol，2003，64:857-865.

29 Myers LK，et al.Peptide-induced suppression of collagen-induced arthritis in HLA-DR1 transgenic mice.Arthritis Rheum，2002，46:3369-3377.

30 Jardetzky TS，et al.Crystallographic analysis of endogenous peptides associated with HLA-DR1 suggests a common polyproline II-like confirmation of bound peptides.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:734-738.