酶解-超聲法對豬苓多糖正交優選提取及抗氧化活性的初步實驗研究

張 元，馮 瓊，楊曉方，谷春秀，劉紅梅

北京聯合大學生物化學工程學院，北京 100023

自由基是生物體中生化反應的普遍中間介質，它們是正常的細胞新陳代謝過程中氧化磷酸化作用產生的副產物［1］。大量研究表明，一方面自由基參與了許多重要的生命過程，諸如細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤的誘發與抑制、肌肉收縮、神經傳導、細胞信號轉導和基因表達等調節;另一方面，自由基產生過多或清除過慢又會影響各種細胞或器官，使自然抗氧化和促氧化之間產生不平衡，誘導產生各種有害影響，使得細胞死亡和脂質過氧化反應的發生［2-4］。因此自由基在有機體中扮演著重要的角色，研究表明眾多從天然產物中提取的多糖如:綠茶、海藻、香菇、云芝等多糖均被證明是有效地天然抗氧化劑和機體免疫劑［5］，且多糖沒有細胞毒性，作用于生物體副作用小，因此其在食品工業、制藥工業等領域得到廣泛應用。但多糖因其種類多樣，結構復雜，分子量大，且多數含量低，極性大，加之其常與蛋白質、脂類等形成復雜的多糖復合物，這些給多糖的提取分離、構效關系、質量標準控制等的研究應用帶來了諸多的困難。

豬苓為多孔菌科真菌豬苓Polyporus umbellatus(Pers.)Fries 的菌核，屬藥食兩用真菌，在我國已有2 000 多年的食用和藥用歷史。豬苓性平味甘，歸腎、膀胱經，具有利水滲濕、泄熱止瀉的功效;用于治小便不利，水腫、泄瀉，淋濁，帶下等［6］。豬苓多糖為豬苓的主要活性成分，其化學組成主要為主鏈由β-(1-3)葡萄糖苷鍵縮合而成的葡聚糖，在主鏈上每3～4 個殘基間出現一個與β-D-吡喃葡糖糖基團作為側鏈的結構［7］，研究表明豬苓多糖具有抑制腫瘤生長、增強免疫力、抗誘變、抗炎、抗病毒、抗化療毒性、抗放射、抗衰老等的活性作用，在臨床上主要用于原發性肺癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、淋巴瘤、白血病等放化療的輔助治療，以提高了患者的抗病能力［8］。

近年來豬苓多糖的研究在結構鑒定和活性上取得了諸多進展，但還有許多問題尚待深入研究解決，如其在天然產物中的含量低，提取效率低，分離困難等問題制約了豬苓多糖的進一步開發和利用。因此綜合考慮提取效率、成本等因素，選擇一種合適的提取分離方法對豬苓多糖的研究開發具有重要的意義。當前，多糖的提取已逐漸由傳統的溶劑提取法向運用酶法、超聲波等輔助強化提取技術轉變。酶法、微波提取法、半仿生法、動態逆流等技術已經逐漸由基礎研究加速向應用生產環節轉化和發展。因此本文酶法-超聲優化提取豬苓多糖展開研究，并對提取的多糖進行體外抗氧化活性的初步評價。擬為應用酶解-微波法輔助技術生產提取豬苓多糖提供一定的實驗依據和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豬苓，購于河北安國長安中藥材公司;果膠酶，纖維素酶(活力單位10000 u/g)，天津市利華酶制劑技術有限公司;D-無水葡萄糖，批號:110833-200503，中國藥品生物制品檢定所;維生素C 注射劑，山東新華制藥股份有限公司。苯酚(分析純)，濃硫酸(分析純)等，北京化工廠。

1.1.2 主要儀器設備

Mini 島津紫外分光光度計。THZ-82 恒溫水浴振蕩器，常州國華電器有限公司。KQ-250 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司等。電子分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取方法與優選

將豬苓進行60 ℃恒溫干燥，粉碎后過100 目篩，稱取一定量的豬苓，進行提取工藝的研究。首先對酶法提取與傳統水提醇沉法和單獨超聲提取實驗做對比，根據實驗結果比對，擬采用復合酶法進行提取，并對影響提取的單因素進行優選，影響條件主要有:酶用量、反應時間、pH 值、溫度，并在此基礎上進行酶法提取的正交試驗，在最佳提取的工藝條件的基礎上，再進行超聲波的提取。

1.2.1.1 水提醇沉法:稱取干燥過篩的豬苓5 g，向其中加入100 mL 水，在40 ℃水浴中浸提1 h，收集上清液，殘渣再次用同種方法提取30 min，合并兩次濾液，用95%的乙醇沉淀，靜置24 h，抽濾，得到提取的多糖。提取的多糖采用無水乙醇、丙酮洗滌各2 次的方式進行除雜后，60 ℃低溫干燥，備用。按1.2.5 所述檢測多糖含量。

1.2.1.2 酶法提取:酶種類的篩選:豬苓粉碎后稱取5 g 三份，加200 mL 蒸餾水;1%纖維素酶;1%果膠酶;1%纖維素酶:果膠酶(1∶1)(質量為豬苓粉末質量的1%，下同)，于50 ℃，自然pH(6.36)條件下浸提1h 后減壓抽濾，多糖處理方法同上。

1.2.1.3 豬苓超聲提取試驗:稱取5 g 豬苓粉末，加入200 mL 水，在50 ℃下，超聲提取20、40、60、80、100 min，抽濾，方法同上。

計算公式:豬苓多糖收率=豬苓多糖質量/豬苓質量×100%。

1.2.2 酶法提取豬苓多糖

1.2.2.1 加酶比例對豬苓多糖提取率的影響

稱取5 份豬苓粉末各5 g，分別至于5 個錐形瓶中，標號，加入纖維素酶與果膠酶(1%)比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1，各加入200 mL 蒸餾水，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。

然后至于水溫為50 ℃的恒溫水浴振蕩器中中速震蕩1 h，再將其置于90 ℃的水浴鍋中5 min 使酶失活，趁熱過濾，提取得到的多糖采用無水乙醇、丙酮洗滌各2 次的方式進行除雜后，60 ℃低溫干燥，稱量，備用。按1.2.5 所述檢測多糖含量。

1.2.2.2 反應溫度的影響

同上，在5 個瓶中分別加入纖維素酶與果膠酶比例為1∶1(質量為1%)。各加入200 mL 蒸餾水，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。然后于水溫分別為35、40、45、50、55 ℃的恒溫水浴振蕩器中中速震蕩1 h。處理方法同1.2.2.1。

1.2.2.3 pH 的影響

同上，5 個瓶加酶加水后，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。并調節pH 值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。方法同上。

1.2.2.4 反應時間的影響

同上，5 個瓶加酶加水后，于室溫下攪拌浸泡30 min，使其充分接觸溶解。然后至于水溫為50 ℃的恒溫水浴振蕩器中分別中速震蕩20、40、60、80、100 min。方法同上。

1.2.3 酶法提取的正交實驗

由以上單因素試驗的結果，確定以溫度(A)、pH 值(B)、加酶比例(C)、反應時間(D)為考察因素，進行正交試驗。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 酶-超聲提取

豬苓以最佳酶解條件反應結束后，再進行超聲輔助浸提，然后繪制提取率與超聲時間的變化曲線。多糖處理方法同1.2.2.1。

1.2.5 測定方法

1.2.5.1 標準曲線的制備

標準曲線的制備根據文獻《酶法提取山藥多糖的工藝研究》［9］，即標準葡萄糖溶液于490 nm 處測定吸光度，以吸光度A 對質量濃度C(mg/mL)進行回歸，得方程:

1.2.5.2 樣品含量測定

精密吸取樣品儲備液1.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，定容到刻度，搖勻，在490 nm 下測得吸光度值為0.64，代入回歸方程。并計算豬苓多糖百分含量，計算公式如下:a%=10/1.0 × (A-0.1165)/1.2152 ×100%。

1.2.6 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

釆用Fenton 法進行測定［10］，以羥自由基清除率作指標。所用多糖為1.2.4 制備的多糖(下同)。具體方法為在比色管中依次加入7.5 mmol/L FeSO43 mL，然后再加入1% H2O23 mL，搖勻后加入6 mmol/L 水楊酸3 mL，搖勻后于37 ℃水浴加熱15 min 后取出，在510 nm 測定其吸光度為A0;然后分別加入不同質量濃度的豬苓多糖溶液(1、2、3、4、5 mg/mL)3 mL，搖勻后繼續水浴加熱15 min，取出測其吸光度為AX。以相同質量濃度的VC溶液為陽性對照。則待測液對輕自由基(·OH)的清除率為:

1.2.7 超氧陰離子自由基清除率測定

釆用鄰苯三酚自氧化法［11］，以超氧陰離子自由基清除率作指標。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速氧化，釋放出O-·2，此自由基能促進鄰苯三酚的自氧化，形成有色中間產物，這些中間產物在320 nm 處有最大吸收，當有抑制劑存在時，可以消除O-·2，從而降低中間產物的積累，使吸光度值降低，根據吸光度的變化評價抗氧化劑的清除能力［10］。以樣品相同質量濃度的VC為陽性對照。具體方法為取不同質量濃度的豬苓多糖溶液(1、2、3、4、5 mg/mL)的水解樣品溶液0.2 mL，加入Tris-HCl 緩沖液2.8 mL，蒸餾水0.4 mL，混勻，置于25 ℃保溫20 min，作為試劑A;取0.2 mL 3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液，置于25 ℃下保溫10 min，作為試劑B;以試劑A 與0.3 mL 10 mmol/L HCl 溶液的混合液作為空白調零后，將試劑A 與試劑B 迅速混合，在320 nm 處測定3 min 內吸光度的變化，回歸求出吸光度變化斜率K1。

以蒸餾水代替水解樣品溶液作為對照樣品重復上述過程，得出吸光度變化的斜率為K0;

計算清除超氧陰離子的能力:

式中:K0為空白對照液的吸光度變化斜率;K1為加入水解液后的吸光度變化斜率。

2 結果與分析

2.1 豬苓多糖收率

從表5 的結果可以看出，單獨的纖維素酶和果膠酶均較傳統的水提溶劑法的收率有所提高，而復合酶法又較單獨的酶法的提取收率為高，因此實驗采用復合酶法提取作為酶法提取的工藝首選。

豬苓超聲提取試驗主要是想驗證在單獨超聲條件下，不同提取時間對豬苓多糖提取的影響，結果表明，收率隨提取隨時間的增加而增加，但當時間大于60 min 后增幅不明顯，當大于80 min 時反而出現下降，下降原因有待進一步分析。因此實驗選擇超聲時間不超過60 min。

表2 豬苓多糖收率Table 2 Productivity of PUPS under different methods

2.2 纖維素酶果膠酶酶解條件的優化

2.2.1 酶用量比的選擇

實驗對復合酶的配比用量進行優選，擬選出最佳加酶用量比。從圖1 可以看出，不同酶的配比對結果的影響，當纖維素酶不變，單獨增加果膠酶的用量，收率并沒有明顯提高。相反，保持果膠酶用量不變，增加纖維素酶的用量反而使多糖的收率下降，因此選擇復合酶最佳酶用量比為1∶1，添加量為1%。

圖1 酶配比用量對豬苓多糖收率的影響Fig.1 Effects of ratio of enzyme on the yield of PUPS

2.2.2 反應溫度的選擇

反應溫度對多糖的收率是一個重要的因素，多糖的收率隨溫度升高，也呈現出升高的趨勢，一方面是因為溫度升高，反應速度加快會促進細胞內部的多糖物質向外擴散。另一方面隨溫度的升高酶的活力不斷增強，在接近其最佳酶活力溫度50 ℃時，反應效率最高。溫度對酶的影響是雙向的，在45～50℃區間酶活力最好，偏離越遠酶活力則越小，因此當溫度上升到55 ℃時，收率反而出現了下降。圖2 實驗的實驗結果最佳的酶解溫度為50 ℃。結果見圖2。

圖2 反應溫度對豬苓多糖收率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on the yield of PUPS

2.2.3 pH 的選擇

實驗結果表明，隨酶解pH 值的升高，豬苓多糖的收率呈現先升高而后下降的趨勢，最佳的pH 6.0～6.5 區間多糖收率最好，以pH 6.5 最佳。因此pH 對酶解效率有一定的影響，可能與酶在酸性環境中活性基團解離使基團的活性得到加強有關。結果見圖3。

圖3 酶解pH 值對豬苓多糖收率的影響ig.3 Effects of enzyme solution pH value on the yield of PUPS

2.2.4 反應時間的選擇

在60 min 內，酶解時間與多糖提取率的關系隨時間的延長而增加，最佳提取時間為60 min。隨后隨反應時間的延長，多糖已基本溶出，呈現平衡態，因此提取效率呈現平穩和緩慢下降的趨勢。結果見圖4。

圖4 酶解時間對豬苓多糖收率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis time on the yield of PUPS

2.3 酶法提取正交實驗結果

根據對正交試驗結果的分析，各單因素對于提取結果影響的順序大小為:溫度＞pH 值＞酶用量＞提取時間。即加酶比例的影響最小，溫度的影響最大，最佳提取工藝為:A2B2C1D3，反應溫度50 ℃，pH=6.5，纖維素酶與果膠酶加酶比例1∶1(1%)，酶解時間60 min。

2.4 酶解-超聲聯合提取

豬苓酶解后，進行超聲提取，在10、20、30、40、50 min 時取樣，測定多糖含量。

表3 酶解正交直觀分析表Table 3 Results of orthogonal test

表4 酶解正交方差分析表(α=0.05)Table 4 Variance analysis table for enzymatic hydrolysis extraction

圖5 酶解-超聲聯合提取條件與豬苓多糖提取率關系Fig.5 Effects of enzymolysis and ultrasonic time on the yield of PUPS

由圖5 可得超聲處理30 min，多糖得率最高6.48%，較處理前4.31%提高了27.12%。聯合提取最佳方案:豬苓5 g，纖維素酶與果膠酶用量比例為1∶1(1%)，蒸餾水200 mL，50 ℃水浴振蕩60 min，超聲提取30 min。

2.5 羥基自由基(·OH)清除能力

豬苓多糖對羥基自由基(·OH)清除作用，并以相同濃度的VC進行對比，結果見圖6 所示，豬苓多糖樣品液對羥基自由基(·OH)有一定的清除作用，且清除率與豬苓多糖的濃度成正比，當多糖液加人量小于3 mg/mL 時，其清除率與VC大致相同相同，當大于4 mg/mL 時，其清除率略高于VC，說明酶法超聲提取的豬苓多糖的抗氧化能力與VC大致相當。

2.6 超氧陰離子自由基清除率

圖6 樣品對羥基自由基的清除作用Fig.6 ·OH scavenging effects of PUPS

圖7 樣品對氧自由基清除作用Fig.7 scavenging effects of PUPS

3 討論

我國野生豬苓分布廣泛、資源豐富，具有巨大的開發潛力。中藥提取技術不僅是中藥制藥過程的重要環節，也是中藥制藥工業技術轉型升級的關鍵。酶法水解提取多糖具有條件溫和、雜質易除和效率高等優點。本實驗采用復合酶水解豬苓提取豬苓多糖，提取效率較傳統的溶劑提取法大幅提高了49.65%。酶法提取多糖的過程中溶劑的用量是影響多糖提取效率的首要因素，這也是生產過程中不可低估的重要經濟指標之一，一般以能浸沒原料的最低的水用量為基礎。實驗前期預實驗結果表明，多糖的浸出率隨溶劑量增加而增加，傳統提取當料液比超過1∶20，并兩次提取后，多糖增加的幅度不大。通過實驗酶法提取的料液比定為1∶40，料液比固定后，就不再將其作為主要的影響因子。復合酶法對中藥的提取效率的提高，原因主要是通過分解破壞中藥材細胞壁的纖維素、半纖維素，以及果膠，從而產生局部的坍塌、溶解，造成組織疏松，這樣就減少了溶劑提取過程中來自于細胞壁和細胞間質的阻力，加快有效組分的溶出速率［12］。實驗表明，復合酶的聯合作用較單一酶的單獨作用的效率要高，原因與復合酶解共同水解破壁效率較單酶效率高，另一方面還與纖維素、半纖維素、果膠酶的水解也會部分增加糖的含量有關。在考察超聲對多糖提取的影響時，超聲對多糖的收率的貢獻進一步從4.31%提高到5.46%。原因與超聲波促進了豬苓組織結構的疏松程度，增大了溶劑提取的滲透性，超聲振動強化了介質的擴散與傳質，避免長時間和高溫對提取物質的降解，同時通過機械作用、熱效應等加速促進豬苓多糖的溶出有關［13］。因此利用酶法-超聲優化提取豬苓多糖，較傳統的溶劑提取豬苓多糖具有反應條件溫和、高效節能、成本低廉、設備簡單、操作方便等優勢，在生產上有很大的發展空間。

對超聲酶法提取的豬苓多糖進行了體外抗氧化活性的驗證實驗，表明它對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有較好的清除作用，其清除能力與多糖的濃度成正比。豬苓多糖對Fenton 法羥自由基清除率在5 mg/mL 濃度條件下達到25.1%，對·OH的清除率達到15.2%，與Vc 的體外抗氧化能力相當，甚至優于Vc。其抗氧化的機理可能與多糖的羥基、羧基、氨基以及硫酸基等復雜的基團結構直接作用于多種活性氧有關，多糖直接參與減少脂質過氧化反應鏈的長度，捕捉脂質過氧化鏈式反應產生的活性氧，從而阻斷或減緩脂質過氧化的進行［14］;其次對于生物體內羥基自由基可快速攝取利用多糖碳鏈上的氫原子生成水;對于氧自由基，多糖的活性基團可與之直接發生氧化反應而清除;對于單線態氧可將激發能量傳遞給多糖使其處于激發態而本身回歸到基態(猝滅)［15］。再次多糖可通過激活體內原有的抗氧化酶的活力如SODGSH-Px 等來清除機體內的脂質過氧化產物，間接發揮抗氧化的作用［16］。

通過酶法-超聲提取豬苓多糖的實驗，不僅提取收率大幅增加，而且提取物體外抗氧化活性的能力與Vc 相當。實驗證實通過該方法能有效的提高豬苓多糖的提取效率，并保持了多糖的活性。這為豬苓多糖的中藥提取制造技術轉型升級和工業化提取應用探索了一條新的路徑。

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