蛋白性半胱氨酸蛋白酶抑制因子(CPIs)及在魚類中的研究進展

李樹紅，蔣然然，馬璐陽

四川農業大學食品學院，雅安 625014

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(Cysteine proteinase inhibitors，CPIs)，是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸(CySH)殘基的蛋白酶水解作用的抑制因子［1］。最近十幾年內，在蛋白性CPIs 領域的研究取得了顯著的進展。雖然上世紀60年代以來發現的Cystatins 仍然是目前鑒定的最徹底的一個超家族，但是近些年來個別新的大家族或一些較小的家族也陸續得到鑒定。事實是，CPIs 廣泛分布在動植物體內，且只要有蛋白酶參與的反應中，都會有蛋白性的調節因子出現。因此，CPIs 在蛋白的分解代謝、生物防御、感染與免疫、癌細胞的侵襲與轉移、細胞凋亡等各生理或病理過程中都發揮著重要作用。然而，目前對魚類CPIs 的鑒定工作尚不完善，其潛在的活性、功能也有待進一步深入研究。因此，本文在介紹了動植物源CPIs 的類群組成，結構特征、抑制機制及其活性、功能的基礎上，進一步系統地綜述了魚類來源的各種CPIs 的純化、鑒定、潛在的活性及功能，并展望了其應用前景。

1 CPIs 的分類

1.1 CPIs 第一類群

根據結構特征的不同，已將蛋白性CPIs 拓展為若干個群。第一群是嚴格意義上的CPIs 超家族(即Cystatins 超家族)。該群主要分為三個亞家族:

(1)Stefins(家族Ⅰ)，約10 kDa，是Cystatins 超家族的原型，無二硫鍵及糖基化側鏈，該抑制劑包括人Stefin A、B，PLCPI(豬白細胞CPI)以及鼠Stefins α 與β 五種形式［2］。

(2)Cystatins(家族Ⅱ)，約12～14 kDa，在原型基礎上，其C-端衍生出具有兩個特征性二硫鍵的肽段，N 端有一胞外定位的信號肽，且通常不具糖基化側鏈，該抑制劑有雞蛋白cystatin 及Cystatins C、D、E/M、F、G(CRES)、S、SN 和SA 幾種形式［2］。

(3)Kininogens(家族Ⅲ)，約50～120 kDa，其重鏈由三個重復的類Cystatin(家族Ⅱ)結構域組成，其中后兩個域表現出抑制活性，而輕鏈(包括域5及域6)決定了其分子量的大小，重鏈和輕鏈之間由血管舒緩激肽(域4)相連接。除重鏈內存在8 個二硫鍵外，重鏈和輕鏈間還有1 個鏈間二硫鍵。Kininogens 在生物體內通常以糖基化的形式存在。目前已知HMW，LMW 和鼠類T-Kininogen 三種類型［3］。

此外，植物源的Cystatins(Phytocystatins)與動物來源的Stefins 和Cystatins(家族Ⅱ)的不同之處僅在于其具有特有的LARFADEHN 共識序列［4］。因此，Phytocystatins 也被劃分為Cystatins 超家族中一個獨特的亞家族。

1.2 CPIs 第二類群

第二群，與第一群的Cystatins 超家族結構相似，但無抑制活性，如胎球蛋白(Fetuins)、富含組氨酸的糖蛋白以及其他Cystatin 相關蛋白及恒定鏈等［5］。有研究表明，除日本響尾蛇(Japanese Habu snake，Trimeresurus flavoviridis)Fetuin 含有13 個半胱氨酸殘基外［6］，其他所有的Fetuins 都包含12 個半胱氨酸殘基。并且已經從人類、小鼠、兔子、牛以及豬血漿中純化出富含組氨酸的糖蛋白［7］。

1.3 CPIs 第三類群

第三群為與Cystatins 超家族不具結構同源性的CPIs，主要包括以下七類:

1.3.1 Thyropins 家族

Thyropins 家族，即甲狀腺球蛋白I 型域(Thyr-1 domain)抑制劑家族［8］，是第三群CPIs 中最大的一類。甲狀腺球蛋白I 型域是富含半胱氨酸的結構單元，以單一或重復序列在多種功能上并不相關的蛋白中存在。主要包括甲狀腺激素類前體、甲狀腺球蛋白、基膜蛋白、巢蛋白(內功素)、睪丸蛋白多糖、睪丸蛋白聚糖、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBPs)，胰腺癌的標志蛋白(GA733)，MHC II-結合的p41 恒定鏈片段［9］、海葵(Sea anemone，Actinia equina)抑 制 劑Equistatin［10］、鮭(Chum salmon，Oncorhynchus keta)卵半胱氨酸蛋白酶抑制劑［11］(ECI)和北美牛蛙(North American bullfrog，Rana catesbiana)血漿中的神經毒素saxiphilin［12］等。其中，經鑒定主要是最后4 種抑制劑對木瓜蛋白酶家族C1 具有可逆抑制活性。甲狀腺球蛋白及巢蛋白(內功素)不具抑制活性，而其他蛋白的抑制活性不清楚或尚未測試。

1.3.2 類/前體肽家族

類木瓜蛋白酶通常以失活酶原的形式翻譯表達。其N 端前體肽的有效抑制導致酶原活性缺失。只有在靶位點，前體肽發生限制性蛋白水解，酶才表現出自身的活性。前體肽是一種競爭性慢結合抑制劑，與廣譜的Cystatins 不同，它對與其同源的酶具有高度的選擇性［2］。除了作為抑制劑外，前體肽還能幫助同源酶正確的折疊和定位，并穩定同源酶。

1.3.3 IAP 家族

細胞凋亡抑制劑IAPs，是一類家族蛋白，其明顯特征是包含了一個或多個含有70 氨基酸殘基以上的鋅結合BIR 域，且每個BIR 包括3 個保守的半胱氨酸殘基和1 個保守的組氨酸殘基［13］。IAPs 被初步鑒定為細胞凋亡抑制因子，能夠直接抑制誘導細胞凋亡的關鍵性半胱氨酸蛋白酶caspases 的活性。

與其他抑制劑蛋白不同，BIR 域并非是一個獨立的抑制單位。對于不同的caspases，IAPs 的抑制機制也不盡相同。因此，IAPs 的分類，是根據與BIR domain 的結構相似性及其在凋亡路徑中的一般性功能，而并非根據其抑制機制。

首次對IAPs 的報道，是發現桿狀病毒中存在細胞凋亡抑制因子p35 蛋白［14］。目前已知從酵母菌到哺乳動物的生物體中均存在IAPs。已經鑒定得到8 個人類IAPs［15］:X 染色體連鎖的IAP(XIAP/ILP-1/MIHA)，c-IAP1 (HIAP-2/MI-HB)，c-IAP2(HIAP-1/MIHC)，神經元凋亡抑制蛋白(NAIP)，生存素(Survivin/TIAP)，Livin(ML-IAP/KIAP)，ILP-2(Ts-IAP)和apollon(Bruce)。其中，前五種IPAs 的過量表達可抑制細胞凋亡。

1.3.4 Calpastatin 家族

Calpastatin 是鈣激活中性半胱氨酸蛋白酶calpains 的一類特異的內源性抑制劑，并不抑制其他半胱氨酸蛋白酶，且Calpains 的活性也只受Calpastatin調節。然而，有學者研究表明Calpastatin 的磷酸化可以影響其對某些calpains 的抑制活性［16］。此外，Calpastatin 與其他已知蛋白無序列相似性［5］。且calpastains 的激活可能與某種細胞凋亡路徑有關，合成的calpain 抑制劑及注射或過量表達calpastain時，能夠使得一些細胞免于凋亡［17，18］。Calpastatin水平的持續降低則可以加快凋亡細胞的死亡速度［18］。

1.3.5 Chagasins 家族

Chagasin (Q966X9)最早是在克氏錐蟲(Trypanozoma cruzi)中發現的一種CPI，對來自錐形蟲的半胱氨酸蛋白酶cruzipain 和木瓜蛋白酶，均具有抑制活性。但是Chagasin 具有類免疫球蛋白的全β 折疊結構，因此與Cystatins 超家族及其他已知群都沒有同源性［19］。此后，Chagasin 的同系物在布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、利什曼蟲屬(Leishmania sp)、瘧原蟲屬(Plasmodium sp)以及細菌(Pseudomonas aeruginosa)的基因組中得到鑒定［20，21］，進而形成了Chagasins 家族。

1.3.6 Mycocypins 家族

Clitocypin(P82314)是一種從水粉杯傘(Clitocybe nebularis)子實體中提取的新型CPI，其氨基酸序列除與從白黃側耳(Pleurotus Cornucopiae)中分離的一種類凝集素蛋白相似外，與任何已知的CPIs 或其他蛋白都沒有明顯的相似性［22］。因此，提出一個新的CPI 家族稱為Mycocypins。該蛋白質以非共價形成的二聚體形式和酶以1∶1 比率結合，從而抑制C1 家族蛋白酶:木瓜蛋白酶、組織蛋白酶L 和B 以及菠蘿蛋白酶。此后，從擔子菌高大環柄菇(Parasol mushroom，Macrolepiota procera)中分離出另一種Mycocypins 家族的抑制因子Macrocypins［23］。

1.3.7 Staphostatins 家族

對葡萄球菌屬微生物半胱氨酸蛋白酶staphospain 具有專一抑制活性的Staphostatins，構成了一個新的抑制因子家族。已經鑒定得到該家族的三個成員，分別是來自金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Staphostatin A 和B，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的Staphostatin A，三者都具有非常嚴格的專一性［24］。

2 CPIs 的結構及抑制機制

1988年Bode W 等［25］利用X 射線衍射法對雞蛋白Cystatin(家族II)和stefin B 進行三維結構分析，表明兩類分子二級結構相似，主要由5 個α-螺旋和5 股反平行的β-折疊片以及1 個附加不完全的α-螺旋所構成，其中β-折疊片包覆、纏繞在α-螺旋的周遭［25］。β1 位于N 端，β2-5 位于C 端。在β 片層的末端，暴露出第1 個β 發卡環(保守序列Q-XV-X-G)，其兩側分別為N 末端區域(含有一個保守的G)和第二個β 發卡環(保守序列P-W)。這3 個存在活性保守序列的結構域形成1 個三邊楔形結構，占據了木瓜蛋白酶的與底物結合的位點，從而起到了抑制木瓜蛋白酶的作用。

3 CPIs 的生理活性、功能

3.1 CPIs 與腫瘤的關系

CPIs 能抑制細胞內外的半胱氨酸蛋白酶，在腫瘤的生長、血管新生、浸潤和轉移中起重要調節作用，可作為腫瘤診斷和預后估計的標志物。Strojan P 等［26］研究頭頸癌發現，高濃度Stefin A 可防止手術后腫瘤復發。此外，Jin L 等［27］研究表明Cystatin E/M(CST6)可以抑制乳癌細胞增生，克隆形成，遷移以及侵入。Kininogen 的域5 及其組成肽具有抑制內皮細胞遷移、增生及血管形成和腫瘤生長的作用［28］。當克隆的人結腸癌細胞SW480-ADH 中缺乏內源Cystatin D 時，外源Cystatin D 的表達既可以抑制體外癌細胞增殖也可以抑制異種移植腫瘤細胞的體內生長。而且，CystatinD 可通過對抗Wnt/β-catenin 信號途徑，抑制c-MYC 及上皮間質轉換誘導因子SNAI1，SNAI2，ZEB1，ZEB2 的表達，抑制癌細胞的分化增殖。相反地，Cystatin D 誘導了E-cadherin等其他粘附蛋白的表達從而增強細胞的粘附性。還能夠抑制癌細胞的遷移和生長，因此Cystatin D 被認為是一個抑制癌癥的候選基因［29］。

3.2 CPIs 與細胞凋亡的關系

此外，CPIs 與細胞凋亡有關。在不同的細胞環境下，Cystatin C 會參與多種信號路徑，從而調節(誘導或抑制)細胞的凋亡，Cystatin C 通過JNK(c-Jun氨基末端激酶抑制劑)-依賴路徑可誘導神經元細胞的凋亡［30］。同時，Kininogen 的域5 可以誘導人皮膚微血管內皮細胞(HDMECs)凋亡并干擾細胞周期［31］，這種抑制也是與培養基質成分有關，而且依賴于細胞內活性氧組分的產生，同時伴隨了谷胱甘肽和內皮細胞脂質過氧化物的清除。此外，氧化性應激促進了培養神經元中Cystatin C 的表達，而Cystatin C 可能對氧化性應激引起的細胞凋亡起到重要的調節作用［32］。而IAPs 則可在人類各種癌細胞中異常大量表達，使得癌細胞逃避凋亡［33］。

3.3 CPIs 與免疫調節的關系

CPIs 與免疫調節，關系密切。Staun-Ram E等［34］研究表明，組織蛋白酶可能在免疫細胞遷移中起作用，因為Cystatin C 可以降低單細胞和T 細胞的遷移能力。同時，組織蛋白酶S 和B 的特異性抑制劑并不影響單細胞遷移，但可以顯著的抑制T 細胞遷移。

有研究表明Cystatin C 在抗原呈遞過程中對恒定鏈Ii 的降解和MHC(主要組織相容性抗原系統major histocompatibility system)的轉運起了不可忽視的調控作用［35］。此外，Cystatins 超家族的3 個家族代表性成員(人Stefin B、雞Cystatin、鼠T-kininogen)均能上調IFN-γ 活化的MPMs(巨噬細胞)合成NO，而對未活化的MPMs 不起作用［36］。并且，CPIs 還能夠通過調節TNF-α、IL-10［37］、IL-6、IFN-γ［38］等免疫相關細胞因子的水平，進而調節T 細胞和巨噬細胞的功能，參與免疫調節［37-39］。

3.4 CPIs 與骨改建調節的關系

CPIs 參與骨改建的調節，具有抑制骨吸收、促進骨形成的活性，這對預防骨質疏松具有意義。然而CPIs 對骨生長的調節機制，尚不完全清楚。研究證實分泌型的Cystatin(家族II)［40，41］和胞內型的人Stefin B(家族I)［42］均可通過抑制骨陷窩中組織蛋白酶Cathepsin K、L 等對骨基質膠原蛋白的降解，起到保護骨有機成分免于過度溶解的作用。同時，近年來發現人Cystatin C 和雞蛋白Cystatin 還能夠抑制破骨細胞的分化和生成，防止骨的過度吸收，但對成熟的破骨細胞無作用［43］。

牛HMW-Kininogen(家族III)經胃蛋白酶消化后釋放的片段1.2(即Domain5)對培養16 h［44］或24 h［45］的OB 有促增殖活性，且片段1.2 經模擬胃液消化后得到的13 KDa 片段(Fr13)和8 KDa 片段(Fr8)，活性仍然存在，能夠促進成骨細胞和軟骨細胞的增殖，并減少成骨細胞的凋亡，利于骨形成［45］。也有學者推測人的Cystatin C 通過BMP2-Runx2-OCN 信號級聯，促進ALP 活性和鈣結節形成，增強骨質礦化［46］。

3.5 CPIs 的抑菌活性

目前，相關研究表明，某些陸生動物及植物來源的Cystatin(家族II)表現了抗菌活性。人類唾液Cystatin C［47］能夠抑制A 鏈球菌群(group Astreptococci)的生長，人［48］及小鼠［49］來源的Cystatin S 能夠抑制牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)的生長;從雞蛋白中提取的Cystatin 在低濃度即可對大腸桿菌(Escherichia coli)和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產生明顯抑制效果［50］;長春花中純化的phytocystatin 能夠抑制大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［51］。Nordahl EA［52］等報道了哺乳動物高分子Kininogen 結構域5 的富含組氨酸的小肽(由20 個氨基酸殘基組成)，能夠有效殺死了革蘭氏陰性腸桿菌、假單胞菌以及革蘭氏陽性的腸球菌。此外Domain 5 中的肽段HKH20(His479-His498)還具有抗真菌活性，能抑制假絲酵母菌屬(Candida)和馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)［53］。

Cystatin 主要作為一種分泌型抑制劑，其抑菌的機制，一方面可能其通過抑制細菌本身分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶而發揮抑菌作用［50］。另一方面Cystatins N 端與半胱氨酸蛋白酶相互作用的保守序列，會與細菌微生物膜上的負電荷相結合［54］，甚至穿透細菌細胞膜，進入細菌內部，抑制胞內半胱氨酸蛋白酶［55］，從而起到抗菌作用。Kininogen 的Domain 5 中的肽段HKH20 則能夠與真菌細胞膜結合［53］。

4 魚類CPIs 的純化鑒定

迄今為止，關于魚類半CPIs 的研究報道較少，許多鑒定工作尚未開展。僅從少數幾類魚中純化了CPIs，而在其分類和作用機制方面的研究尚不深入。

4.1 Stefins

從玻璃魚(Glassfish，Liparis tanakai)卵中純化的18 kDa 的CPI，因不具有活性必需的二硫鍵，因此被推測為Stefin 類(家族I)［56］。

4.2 Cystatins

繼在大麻哈魚(Chum salmon，Oncorhynchus keta)的多個組織(肝臟、卵巢、睪丸、心臟、紅色肌、白色肌、血清、腎、胃、鰓、皮、腸、盲腸管等)中發現CPIs 抑制活性［57］后，又從其腦下垂體中純化并鑒定出了分子量14 kDa 的Cystatin(家族II)，由111 個氨基酸序列組成，在C 端66～75 和89～109 位存在兩個二硫鍵。其抑制活性位點與雞卵白蛋白Cystatin 一致即Gly(4)，Gln-X-Val-X-Gly(48-52)，Ile(Val)-Pro-Trp(96～98)［58］。

從歐洲金鯽(Golden crucianCarassius auratus)卵中純化出了在還原條件下分子量為11.9 和14.4 kDa，而在非還原條件下分子量為13.5 和12.7kDa的cst-I 和cst-II。cst-I 片段與普通鯽魚Cystatin 氨基酸序列間有88.9%的同源性，而與其他水生動物Cystatins 的N 端序列有44.4%～55.6%的同源性，因此推測其屬于家族II［59］。

臺灣學者對普通鯉魚(Carp，Cyprinus carpio)卵CPI(具有家族II 的部分特征)進行的純化、活性及結構鑒定及克隆表達，其與雞蛋白Cystatin(家族II)、鱘魚、鮭魚以及人的Cystatin C 的同源性較低［60，61］。且容易形成二聚體，可能與其蛋白序列中親水性Met 62 的位置有關［62］。

此外，從鰱魚(Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix)卵中分離純化的小分子CPIs 組分(10.5 kDa、16.5 kDa 和12 kDa、7kD 和10kd)均可顯著的抑制半胱氨酸組織蛋白酶引起的肌球蛋白的降解［63，64］。

4.3 Kininogens

Kim Y 及Li DK 等2006 及2008年［65，66］陸續報道了從大麻哈魚(Chum salmon，Oncorhynchus Keta)的卵及血漿中純化出了72.6 kDa 和70 kDa 的高分子CPIs，并推測為Kininogen(家族III)。其中，卵中純化的72.6 kDa 的CPI，是由2 條分子量分別為54和18.6 kDa 的多肽鏈組成的異源二聚體，對木瓜蛋白酶的抑制活性低于70 kDa 抑制劑蛋白。

芬蘭學者從大西洋鮭魚(Atlantic salmon，Salmo salarL.)［67］、花狼鳚(Spotted wolfish，Anarhichas minor)及大西洋鱈魚(Atlantic cod，Gadus morhua)［68］皮膚中純化的52 kDa、51.0 kDa 和45.8 kDa 的CPI，因其序列中含有魚的bradykinin 結構域，因此將其歸為Kininogens(家族III)。上述三種Kininogens(家族III)都具有脊椎動物中常見的唾液酸化的二天線或三天線型的N-糖苷多糖和雙唾液酸化一型核的O-糖苷多糖。此外，不同的糖基化作用也導致CPIs 產生了不同的等電點［68］。

此外，宋川從鰱魚(Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix)卵中純化出了89 kDa 大分子CPI-I，為糖蛋白，且可抑制鰱魚組織蛋白酶L，并具有顯著的熱穩性［69］。

4.4 Thyropins

在大麻哈魚(Chum salmon，Oncorhynchus keta)卵中又純化了一種Thyropin 類的9 kDa CPI，其類thyroglobulin 的結構域功能尚不清楚，抑制作用機制也有待研究［70］。

4.5 類前體肽類

Olonen A［71］等證明在大西洋鮭魚(Atlantic salmon，Salmo salarL)以及紅點鮭(Arctic charr，Salvelinus alpinus)中存在的salarin gene 編碼了一種類似前體肽的CPI，并從大西洋鮭(Atlantic salmon，Salmo salarL)魚皮中分離得到了分子量43 kDa，pI 5.1 的一種新型的類似前體肽的CP，即salarin，其可以抑制木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶，但不抑制胰蛋白酶［67］。

4.6 Calpastatin

除了從虹鱒魚(Rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)［72］中克隆表達出兩種Calpastatins 外，還有學者［73］從大西洋鮭(Atlantic salmon，Salmo salarL.)魚肉中純化出兩種Calpastatins，而在哺乳動物只發現了一種Calpastatin，這些都暗示了魚肉Calpastatin 與哺乳動物不同。與哺乳動物Calpastatins相比，魚類Calpastatins 具有更少的重復抑制區域［72］Calpastatins 表達與抑制活性與魚肉片品質之間存在潛在關聯［74］。

4.7 其他新類別

日本學者依次從日本鰻魚(Anguilla japonica)皮膚粘液中純化的Eel-CPI-1［75］以及Eel-CPI-2、Eel-CPI-3［76］，僅能抑制木瓜蛋白酶對蛋白大分子底物的水解。該類CPI 可能與木瓜蛋白酶以非共價鍵方式結合，其氨基酸組成和分子量及N 端封閉的結構特征都分別與日本鰻魚皮膚粘液中的凝集素AJL2以及AJL1 很相似，因此，推測可能是一類新蛋白酶抑制劑，但尚需要進一步證實。

總之，有關魚類CPIs 的分子結構、種類組成、生理活性等有待進一步研究。

5 魚類CPIs 的活性及功能

魚類由于其進化地位和生活環境的特殊性，其CPIs 可能在結構和功能方面，與哺乳動物有所差異，甚至存在某種特殊的活性或作用機制。然而目前對魚類CPIs 功能了解甚微，相關報道也寥寥無幾。

5.1 CPIs 在發育保護方面的作用

鱸魚孵化后7 d 的卵中Cathepsin L 活性越高，孵化率越低［77］。Li F 等［78］研究表明在虹 鱒魚(Rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)胚胎組織中Cystatin C(家族II)的mRNA 表達豐富，可能對發育中的胚胎有保護作用。另外，近年來有學者研究證明鯉魚卵Cystatin 能夠通過凝集精子防止鯉魚卵多精受精，并且其抑制能力受鹽濃度和pH 的影響很大［79］。

5.2 CPIs 在免疫調節方面的作用

Li S 等［80］研究發現克隆表達的大黃魚(Large yellow，CroakerLarimichthys crocea)Cystatin(家族II)類似物，注射后能夠刺激大黃魚脾和腎中免疫相關基因TNF-α 和IL-10 mRNA 水平的上調。另外，其研究還表明，在三聯滅活細菌疫苗或poly(I:C)作為刺激物進行誘導后，Lycstefin 基因在大黃魚腎和脾中的轉錄產物有不同程度的上調，在血液中則有不同程度的下調，同時還表明Lycstefin 參與細菌或病毒引起的免疫應答，對細菌引起的免疫反應在較晚時間作出應答［81］。此外，大菱鲆(Turbot，Scophthalmus maximus)的Stefin B(家族I)參與了抗細菌感染的免疫機制，其基因SmCytB 在頭腎巨噬細胞中瞬間過量表達，提高了巨噬細胞的抗菌活性［82］。

魚皮膚本身就是魚對病原體的一個防御屏障，而魚皮膚及其粘液中存在多種類型CPIs［75，76］，尤其具有保護型多糖結構的Kininogen［83］，都可能說明它們通過某種尚不明確的途徑起到防御媒介的作用，參與魚類先天免疫。

5.3 CPIs 在抑制腫瘤中的作用

虹鱒 魚(Rainbow trout，Oncorhynchus mykiss)Cystatin C 的mRNA 在其黃曲霉毒素誘導的肝腫瘤細胞中表達量明顯高于與正常肝細胞，說明Cystatin C 可能與魚類的腫瘤發生之間具有某種潛在調節關系。作者所在團隊前期從鰱魚(Silver carp，Hypophthalmichthys molitrix)卵中分離的CPIs 在體外抑制了子宮內膜癌(Ishikawa)細胞的增殖，使其遷移及粘附能力顯著下降［84］。

5.4 CPIs 在調節骨生長方面的作用

目前，除本實驗室對鰱魚Cystatin 在成骨細胞增殖分化方面進行了探索研究外，尚未見魚源CPIs的相關報道。作者所在團隊前期研究發現，鰱魚Cystatin 能夠促進小鼠MC3T3-E1 成骨細胞的增殖和分化，促進骨形成［85］。

5.5 CPIs 在抑菌方面的作用

目前，除本實驗室對鰱魚Cystatin 的抑菌活性進行了相關研究外，尚未見魚源CPIs 抑菌活性的研究報道。作者所在團隊前期研究發現，鰱魚Cystatin對銅綠假單胞菌［86］及冷藏魚肉片中的優勢腐敗菌熒光假單胞菌［87］，具有顯著的抑制效果，推測其可能在水產原料及其冷藏制品貯藏過程中，發揮良好的防腐保鮮作用。

6 展望

蛋白性CPIs 在動植物界廣泛存在，且種類較多。目前對陸生動物研究較透徹。而魚類CPIs 研究較少，但其很可能存在某些不同與陸生動物的特殊的活性或作用機制。然而近年來對于魚類CPIs的探索性應用研究，僅局限于抑制魚糜凝膠或魚肉質軟化，如大馬哈魚卵cystatin 可以有效抑制狹鱈魚糜的凝膠軟化。添加純化的鰱魚卵小分子CPIs 均可顯著的提高鰱魚魚糜的凝膠強度，尚未將其作為一種生物活性成分進行系統的研究、開發利用。同時，已知蛋白性CPIs 具有癌癥抑制、免疫調節、促進骨生長以及刺激細胞凋亡等多種生理活性功能及顯著的抑菌活性。因此，對魚類CPIs 進行分離純化鑒定，并進一步探究其各種活性及功能具有重要的意義。同時，利用其抑菌、抑制腫瘤等功能作用，應用于食品、醫藥等領域，必定具有廣闊的前景。

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