包頭地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌分離鑒定的研究

李玉娟 王殿柱

1.內(nèi)蒙古包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)牧園林工程學(xué)院；2.內(nèi)蒙古包頭稀土高新區(qū)獸醫(yī)站

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.試驗(yàn)動(dòng)物

包頭市昆區(qū)、青山、九原、石拐等地的各個(gè)大型養(yǎng)殖場(chǎng)、養(yǎng)殖基地及散養(yǎng)戶(hù)患子宮內(nèi)膜炎奶牛。

2.試驗(yàn)藥品及試劑

本試驗(yàn)所用試劑：Barid-parker （B-P） 瓊脂培養(yǎng)基、Mueller-Hinton（M-H）肉湯、血平板培養(yǎng)基均為青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；革蘭染色液為廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒為北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

二、試驗(yàn)方法

1.樣品采集

本試驗(yàn)對(duì)120 頭被臨床獸醫(yī)診斷為臨床型子宮內(nèi)膜炎的奶牛做直腸檢查，并采用直腸把握法采集子宮分泌物，并將其編號(hào)，封蓋，貼上標(biāo)簽，置冰箱（-20℃）保存待檢。

2.葡萄球菌的分離及鑒定

（1）奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離。 將采集到的子宮分泌物按常規(guī)方法進(jìn)行前增菌；挑取前增菌菌液進(jìn)行劃線(xiàn)接種；將疑似葡萄球菌進(jìn)行純培養(yǎng)。

（2）葡萄球菌初步鑒定。 葡萄球菌初步鑒定主要是革蘭染色鏡檢。 具體方法參照薛秀恒（2012）。

（3）葡萄球菌的分子生物學(xué)鑒定。采用PCR 方法對(duì)分離到的葡萄球菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。 根據(jù)Ghebremedhin（2008）等報(bào)道的引物序列，合成gap 基因的引物，引物信息與反應(yīng)條件見(jiàn)表1。

表1 葡萄球菌分子生物學(xué)鑒定PCR 反應(yīng)引物信息

三、試驗(yàn)結(jié)果

1. 包頭不同轄區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離結(jié)果

本試驗(yàn)從包頭不同轄區(qū)（昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)及石拐區(qū)）的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)、養(yǎng)殖基地及散養(yǎng)戶(hù)中共選取了120 頭患子宮內(nèi)膜炎的奶牛， 并采集其子宮分泌物，共分離到葡萄球菌50 株（41.7%）。 結(jié)果顯示，昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)及石拐區(qū)患子宮內(nèi)膜炎分泌物中的葡萄球菌分離率分別為43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。包頭市不同轄區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離情況見(jiàn)圖1。

2.葡萄球菌分離鑒定結(jié)果

（1）葡萄球菌初步鑒定結(jié)果。 本試驗(yàn)分離到的葡萄球菌在巴爾德帕克瓊脂平板上的菌落形態(tài)見(jiàn)圖2；革蘭染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖3。

（2）葡萄球菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果。采用PCR 方法對(duì)本試驗(yàn)分離到的菌株做分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4， 并且圖中僅顯示部分菌株的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果。 結(jié)果顯示：50 株經(jīng)初步鑒定的分離菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29213 均出現(xiàn)目的條帶。

圖1 包頭市不同轄區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離情況

圖2 分離葡萄球菌菌落形態(tài)圖（巴爾德帕克氏瓊脂）

圖3 分離葡萄球菌菌落形態(tài)圖（革蘭染色）

圖4 葡萄球菌gap 基因PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

四、討論

1.奶牛子宮內(nèi)膜炎(endometritis)又稱(chēng)產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎，是奶牛產(chǎn)后僅局限于子宮發(fā)生炎癥性變化的一種常見(jiàn)產(chǎn)科疾病。 引起該病的病因很多, 但病原微生物感染是其發(fā)生的直接原因。 在我國(guó)，奶?；甲訉m內(nèi)膜炎的情況也是非常嚴(yán)重的。杜光波等對(duì)淮安地區(qū)部分奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中患子宮內(nèi)膜炎的奶牛發(fā)病規(guī)律進(jìn)行調(diào)查， 結(jié)果顯示： 奶牛子宮內(nèi)膜炎平均發(fā)病率為34.6%。 史同瑞對(duì)黑龍江省多個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行奶牛疾病調(diào)查，結(jié)果顯示：奶牛患子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率為30%，占產(chǎn)科疾病發(fā)病率的24.62%。

眾所周知， 治療奶牛子宮內(nèi)膜炎不僅費(fèi)用高、耗精力,而且還會(huì)延長(zhǎng)奶牛的產(chǎn)犢間隔,嚴(yán)重影響奶牛的繁殖力和生產(chǎn)性能, 降低了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，了解哪些病原微生物對(duì)奶牛具有感染，對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。

2.本試驗(yàn)從包頭多個(gè)轄區(qū)（昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)以及石拐區(qū)）的各個(gè)大型養(yǎng)殖場(chǎng)、養(yǎng)殖基地及散養(yǎng)戶(hù)總共采集了患子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮分泌物120 份，共分離到葡萄球菌50 株，分離率為41.7% 。 彭宇等報(bào)道江蘇省奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率為61.9%，王爽等報(bào)道黑龍江地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率為22.86%， 張子恒等在豫南地區(qū)母牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定的實(shí)驗(yàn)研究中，報(bào)道葡萄球菌的分離率為26.87%， 這些數(shù)據(jù)除江蘇省外均比本試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果低，出現(xiàn)這一結(jié)果可能的原因是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原微生物會(huì)因地區(qū)不同而存在差異，或者是由采樣局限性造成的。 本試驗(yàn)結(jié)果與朱憲光等報(bào)道內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率（50.0%）相近，表明地區(qū)相同或相近奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率相近。 綜上所述，葡萄球菌是引起該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌之一。為指導(dǎo)該地區(qū)獸醫(yī)臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

五、結(jié)論

1.本試驗(yàn)從包頭昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)及石拐區(qū)患子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮分泌物中分離到葡萄球菌的分離率分別為43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。

2.本試驗(yàn)共分離到50 株（41.7%）葡萄球菌。

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