包頭地區奶牛子宮內膜炎致病菌分離鑒定的研究

李玉娟 王殿柱

1.內蒙古包頭輕工職業技術學院農牧園林工程學院；2.內蒙古包頭稀土高新區獸醫站

一、實驗材料

1.試驗動物

包頭市昆區、青山、九原、石拐等地的各個大型養殖場、養殖基地及散養戶患子宮內膜炎奶牛。

2.試驗藥品及試劑

本試驗所用試劑：Barid-parker （B-P） 瓊脂培養基、Mueller-Hinton（M-H）肉湯、血平板培養基均為青島海博生物技術有限公司生產；革蘭染色液為廣東環凱生物技術有限公司生產； 細菌基因組DNA 提取試劑盒為北京天根生物技術有限公司生產。

二、試驗方法

1.樣品采集

本試驗對120 頭被臨床獸醫診斷為臨床型子宮內膜炎的奶牛做直腸檢查，并采用直腸把握法采集子宮分泌物，并將其編號，封蓋，貼上標簽，置冰箱（-20℃）保存待檢。

2.葡萄球菌的分離及鑒定

（1）奶牛子宮內膜炎葡萄球菌分離。 將采集到的子宮分泌物按常規方法進行前增菌；挑取前增菌菌液進行劃線接種；將疑似葡萄球菌進行純培養。

（2）葡萄球菌初步鑒定。 葡萄球菌初步鑒定主要是革蘭染色鏡檢。 具體方法參照薛秀恒（2012）。

（3）葡萄球菌的分子生物學鑒定。采用PCR 方法對分離到的葡萄球菌進行分子生物學鑒定。 根據Ghebremedhin（2008）等報道的引物序列，合成gap 基因的引物，引物信息與反應條件見表1。

表1 葡萄球菌分子生物學鑒定PCR 反應引物信息

三、試驗結果

1. 包頭不同轄區奶牛子宮內膜炎葡萄球菌分離結果

本試驗從包頭不同轄區（昆區、青山區、九原區及石拐區）的奶牛養殖場、養殖基地及散養戶中共選取了120 頭患子宮內膜炎的奶牛， 并采集其子宮分泌物，共分離到葡萄球菌50 株（41.7%）。 結果顯示，昆區、青山區、九原區及石拐區患子宮內膜炎分泌物中的葡萄球菌分離率分別為43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。包頭市不同轄區奶牛子宮內膜炎葡萄球菌分離情況見圖1。

2.葡萄球菌分離鑒定結果

（1）葡萄球菌初步鑒定結果。 本試驗分離到的葡萄球菌在巴爾德帕克瓊脂平板上的菌落形態見圖2；革蘭染色鏡檢結果見圖3。

（2）葡萄球菌分子生物學鑒定結果。采用PCR 方法對本試驗分離到的菌株做分子生物學鑒定，結果見圖4， 并且圖中僅顯示部分菌株的PCR 產物電泳結果。 結果顯示：50 株經初步鑒定的分離菌與標準菌株ATCC 29213 均出現目的條帶。

圖1 包頭市不同轄區奶牛子宮內膜炎葡萄球菌分離情況

圖2 分離葡萄球菌菌落形態圖（巴爾德帕克氏瓊脂）

圖3 分離葡萄球菌菌落形態圖（革蘭染色）

圖4 葡萄球菌gap 基因PCR 產物電泳檢測結果

四、討論

1.奶牛子宮內膜炎(endometritis)又稱產后子宮內膜炎，是奶牛產后僅局限于子宮發生炎癥性變化的一種常見產科疾病。 引起該病的病因很多, 但病原微生物感染是其發生的直接原因。 在我國，奶牛患子宮內膜炎的情況也是非常嚴重的。杜光波等對淮安地區部分奶牛養殖場中患子宮內膜炎的奶牛發病規律進行調查， 結果顯示： 奶牛子宮內膜炎平均發病率為34.6%。 史同瑞對黑龍江省多個奶牛養殖場進行奶牛疾病調查，結果顯示：奶牛患子宮內膜炎的發病率為30%，占產科疾病發病率的24.62%。

眾所周知， 治療奶牛子宮內膜炎不僅費用高、耗精力,而且還會延長奶牛的產犢間隔,嚴重影響奶牛的繁殖力和生產性能, 降低了奶牛養殖業的經濟效益。因此，了解哪些病原微生物對奶牛具有感染，對奶牛養殖業具有重要意義。

2.本試驗從包頭多個轄區（昆區、青山區、九原區以及石拐區）的各個大型養殖場、養殖基地及散養戶總共采集了患子宮內膜炎奶牛的子宮分泌物120 份，共分離到葡萄球菌50 株，分離率為41.7% 。 彭宇等報道江蘇省奶牛子宮內膜炎葡萄球菌的分離率為61.9%，王爽等報道黑龍江地區奶牛子宮內膜炎葡萄球菌的分離率為22.86%， 張子恒等在豫南地區母牛子宮內膜炎致病菌的分離鑒定的實驗研究中，報道葡萄球菌的分離率為26.87%， 這些數據除江蘇省外均比本試驗實驗結果低，出現這一結果可能的原因是引起奶牛子宮內膜炎的病原微生物會因地區不同而存在差異，或者是由采樣局限性造成的。 本試驗結果與朱憲光等報道內蒙古呼和浩特地區奶牛子宮內膜炎葡萄球菌的分離率（50.0%）相近，表明地區相同或相近奶牛子宮內膜炎葡萄球菌的分離率相近。 綜上所述，葡萄球菌是引起該地區奶牛子宮內膜炎的主要病原菌之一。為指導該地區獸醫臨床合理用藥提供科學依據。

五、結論

1.本試驗從包頭昆區、青山區、九原區及石拐區患子宮內膜炎奶牛的子宮分泌物中分離到葡萄球菌的分離率分別為43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。

2.本試驗共分離到50 株（41.7%）葡萄球菌。

[1]薛秀恒,孫茂忠,王菊花,等.安徽不同地區奶站牛奶中金黃色葡萄球菌及其腸毒素污染狀況評估[J].Chinese Journal of Microecology，2012,24 (4)：1005-376.

[2]Ghebrmedhin B, Layer F,Konig W et al. Genetic Classification and Distinguishing of Staphylococcus Species Based on Different Partial gap, 16S rRNA,hsp60, rpoB, sodA, and tuf Gene Sequences [J].Clin.Microbiol, 2008, 46(3)： 1019-1025.

[3]Gilbert RO, Shin ST, Guard CL, Erb HN,Frajblat M. Prevalence of endometritis and its effects on reproductive performance of dairy cows.Theriogenology.2005,64（9）：1879-1888.

[4]杜光波，徐莉，高夢寧等. 奶牛子宮內膜炎主要病原菌的調查[J].畜牧獸醫，2007，39（4）： 24-26.

[5]史同瑞，于萬才，王觀悅等.奶牛子宮炎發病情況調查及綜合性應對措施[J].畜牧獸醫科技信息，2005，08：85-86.

[6]彭宇，王一昊，朱偉云等. 產后奶牛子宮內微生物菌群動態變化及其與子宮黏液性狀關系的研究[J].畜牧獸醫學報,2012,43(8)：1292-1297.

[7]王爽，和翀翼，劉文等. 黑龍江地區奶牛子宮內膜炎病原菌的分離鑒定與藥物敏感性試驗[J].中國獸藥雜志，2008，42（5）：33-35.

[8]張子恒，鄧立新等. 豫南地區母牛子宮內膜炎致病菌的分離鑒定[J].中國牛業進展，2010，560-564.

[9]朱憲光，閆紅霞，鳳英等.呼和浩特周邊地區奶牛子宮內膜炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗[J].畜牧與飼料科學，2010，31（6-7）：228-229.