稻綠核菌胞外多糖抗氧化活性和培養基優化

呂仕瓊，于瑞婷，董雪嬌，林鋒科，徐 丹，岳 陽，賴道萬，周立剛

中國農業大學農學與生物技術學院，北京 100193

稻曲病(Rice false smut)是危害水稻穗部的真菌病害，其病原為稻綠核菌(有性態:Villosiclava virens;無性態:Ustilaginoidea virens)，稻曲病會嚴重影響水稻的產量和品質［1，2］。稻綠核菌能產生稻曲菌素(Ustiloxins)和稻綠核菌素(Ustilaginoidins)等次生代謝產物，具有多種生物活性和應用開發潛力。稻曲菌素為環肽類化合物，主要表現為細胞毒和抗腫瘤活性［3-5］。稻綠核菌素為二萘并-γ-吡喃酮類化合物(Bis-naphtho-γ-pyrones)，具有細胞毒活性［6］、抗菌活性［7，8］、HIV 整合酶抑制活性［9］等。

在大規模發酵培養稻綠核菌UV-2 制備稻曲菌素和稻綠核菌素的同時，本研究對該真菌產生的多糖及其抗氧化活性進行了研究，制備得到菌絲水提多糖(WPS)、菌絲堿提多糖(SPS)和胞外多糖(EPS)，其中胞外多糖具有較好的抗氧化活性。進一步對生產胞外多糖的培養基進行優化，有效提高了胞外多糖的得率，為將來大規模培養稻綠核菌生產活性物質提供了依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

稻綠核菌(Vilosiclava virens)UV-2 菌株(下同)為稻曲病病原，由江蘇省農業科學院植物保護研究所陳志誼研究員提供。稻綠核菌于4 ℃下保存在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂(PDA)培養基上。

1.2 儀器與試劑

Power Wave HT 多孔板分光光度計(美國BioTek 公司)、TU-1810 分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)、FreeZone 冰凍干燥機(美國Labconco 公司)、DELTA-320 型pH 計(Mettler Toledo 儀器上海有限公司)、LS-B55L 型立式壓力蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫療儀器廠)、FLC-3 型超凈工作臺(哈爾濱東聯電子技術開發有限公司)、AL-104 型電子分析天平(Mettler Toledo 儀器上海有限公司)、DRP-9162 型恒溫培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)、TS-8 型轉移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、RE50 型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)、KQ5200DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)等。所用試劑均為分析純。

1.3 多糖的制備

1.3.1 稻綠核菌的發酵培養

從保種管中挑起少許菌絲接種到PDA 平板上活化10 d 左右，挑取活化的菌絲接種于250 mL 的三角瓶中，每瓶裝100 mL 馬鈴薯-葡萄糖(PD)培養液，于28 ℃，150 rpm 搖培7 d 左右，作為種子培養液備用。

每1 L 稻綠核菌的發酵培養液中含:葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、FeSO4·7H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO40.6、NaCl 0.6 g，初始pH 值為7.0。250 mL 三角瓶中裝發酵培養液100 mL，接種10 個大小一致的菌絲球。于28 ℃、150 rpm 暗培養25 d后收獲，共200 瓶，發酵液總體積20 L。收獲的發酵液經抽濾，獲得菌絲和菌液。經冰凍干燥后的菌絲(203.9 g)用于提取菌絲水提多糖(WPS)和堿提多糖(SPS)。菌液(20 L)濃縮至1 L，用于制備胞外多糖(EPS)。

1.3.2 稻綠核菌菌絲水提多糖的制備

真菌菌絲水提多糖(WPS)的制備參考Li 等的方法［10］。具體步驟如下:將凍干的稻綠核菌菌絲研碎，經脫脂后，晾干，稱取一定量(100 g)，添加蒸餾水，水料比約為30∶1(v/w)，置于熱回流提取器內，90 ℃條件下提取3 次，每次2 h。離心后殘渣用于菌絲堿提多糖的提取，上清液合并，減壓濃縮到小體積，向濃縮的提取液中加入3 倍體積的無水乙醇，4℃醇沉48 h。離心(17418 g)15 min 后，去除上清液，用乙醇和丙酮反復洗滌沉淀，得菌絲水提粗多糖，再經脫脂、脫蛋白、脫色和透析處理，最終收集透析袋中的溶液，經濃縮、冰凍干燥，獲得稻綠核菌UV-2 菌絲水提多糖(0.26 g)。

1.3.3 稻綠核菌菌絲堿提多糖的制備

真菌菌絲堿提多糖(SPS)的制備參考Li 等的方法［10］，具體步驟如下:將上述已提取菌絲水提多糖的菌絲殘渣(約100 g)，在1 M 的NaOH 溶液中室溫浸提24 h。離心去除殘渣，收集上清液，減壓濃縮到小體積，向濃縮得提取液中加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉48 h。離心(17418 g)15 min 后，去除上清液，用乙醇和丙酮反復洗滌沉淀，得菌絲堿提粗多糖，再經脫脂、脫蛋白、脫色和透析處理，最終收集透析袋中的溶液，經濃縮、冰凍干燥，獲得稻綠核菌UV-2 菌絲堿提多糖(0.31 g)。

1.3.4 稻綠核菌胞外多糖的制備

真菌胞外多糖(EPS)的制備參考Li 等的方法［11］，具體步驟如下:向濃縮的菌液中加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉48 h。離心(17418 g)15 min 后，去除上清液，用乙醇和丙酮反復洗滌沉淀，得胞外粗多糖，再經脫脂、脫蛋白、脫色和透析處理，最終收集透析袋中的溶液，經濃縮、冰凍干燥，獲得稻綠核菌UV-2 胞外多糖(5.48 g)。

1.4 多糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸法測定糖含量［12］。首先配制濃度為1.0 mg/mL 的葡萄糖母液，稀釋至系列梯度濃度的標準溶液，濃度范圍為0.02～0.12 mg/mL。然后，吸取2 mL 葡萄糖溶液于試管中，置于冰浴中，隨即添加5 mL 濃度為0.2%的蒽酮-硫酸溶液，迅速搖勻。在沸水浴中反應15 min 后，迅速轉移至冰浴中終止反應，室溫靜置15 min。用分光光度計在最大吸收波長620 nm 下測定各個反應液吸光值。標準曲線為Y=5.4143X+0.0982 (R2=0.9949):Y為620 nm 下的吸光值，X 為實際反應的葡萄糖量(mg)。稱取一定量的多糖樣品(EPS、WPS、SPS)，配制成適當濃度的溶液，實驗步驟同于標準品葡萄糖。通過測定620 nm 下的吸光值，即可計算出糖含量。

1.5 多糖抗氧化活性的測定

1.5.1 Fe3+還原能力的測定

參考Fan 等方法［13］。首先，配制以下4 種溶液備用:濃度為0.2 M pH 6.6 的磷酸緩沖溶液100 mL;濃度均為1%的鐵氰化鉀水溶液和三氯化鐵水溶液各50 mL;濃度為10%的三氯乙酸溶液50 mL。接著，配制系列梯度濃度樣品溶液，陽性對照為2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(Butylated hydroxytoluene，BHT)。Fe3+還原能力的測定步驟如下:向96 微孔板中依次加入50 μL 樣品溶液，20 μL 1%的鐵氰化鉀和30 μL 磷酸緩沖溶液，振蕩混勻，在50 ℃下反應20 min。待冷卻至室溫，反應孔中再加入70 μL 10%的三氯乙酸溶液和10 μL 1%三氯化鐵溶液。振蕩混勻，室溫反應10 min。測定其在700 nm 下的吸光值。

1.5.2 羥基自由基(·OH)清除能力測定

參考Thirunavukkarasu 等方法［14］。配制濃度2 mg/mL 的FeSO4·7H2O 100 mL;1.5 mg/mL 的水楊酸(Salicylic acid)溶液150 mL;配制1%的H2O2溶液;配制系列梯度濃度樣品溶液，以抗壞血酸(Ascorbic acid，AA)作為陽性對照，乙醇作為陰性對照。反應體系如下:首先，向微孔板中依次加入25 μL 2 mg/mL 的FeSO4·7H2O 溶液，50 μL 1%的H2O2溶液，50 μL 1.5 mg/mL 的水楊酸溶液和50 μL 樣品溶液，振蕩混勻，37 ℃反應1 h。然后用微孔板分光光度計測定其在525 nm 下的吸光值。每個處理4個重復。

D0:添加50 μL 蒸餾水代替樣品液反應體系的吸光值;D1:添加50 μL 樣品液反應體系的吸光值;D2:50 μL 乙醇代替50 μL 水楊酸溶液時反應體系的吸光值。

建立以供試樣品濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，·OH 清除率(%)為縱坐標(Y)的線性回歸方程Y=aX+b，以此求得樣品·OH 清除能力的有效中濃度EC50。

1.6 Plackett-Burman 實驗

采用Plackett-Burman(P-B)實驗優化培養基組成［15］，生產稻綠核菌胞外多糖(EPS)。發酵培養基為:葡萄糖、蛋白胨、FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaCl、pH 調至7.0。胞外多糖的制備過程同1.3.4，糖含量的測定同1.4。以稻綠核菌胞外多糖的得率(mg/L)作為唯一檢測指標。胞外多糖得率(mg/L)=EPS 干重(g/L)× EPS 糖含量(%)。使用Expert-Design 8.0 軟件，選用Plackett-Burman實驗設計篩選主效因子。本研究設計了7 個因子，共進行12 組實驗，每組實驗重復4 次。表1 中為PB 實驗中研究的7 個變量及其水平。按照Plackett-Burman 實驗配制各種培養基，分裝于250 mL 三角瓶中，每瓶裝入100 mL 相應配比的培養液，高壓蒸汽滅菌15 min，待其冷卻后接種。種子培養基及接種量及其培養條件如1.3.1 所示。收獲后，制備稻綠核菌EPS，計算其得率。

表1 Plackett-Burman 實驗中的變量及其水平Table 1 Levels and values of the variables tested in Plackett-Burman design

1.7 單因素實驗

葡萄糖單因素實驗:研究了葡萄糖分別為40、50、60、70、80 和90 g/L，蛋白胨為10 g/L，FeSO4·7H2O 為0.05 g/L，MgSO4·7H2O 為0.2 g/L，K2HPO4為0.6 g/L，NaCl 為0.6 g/L，初始pH 調至7.0 條件下稻綠核菌EPS 的得率。從而確定中心組合設計(CCD)中主效因子葡萄糖的取值范圍。

蛋白胨單因素實驗:研究了蛋白胨分別為5、10、15、20、25 和30 g/L，葡萄糖為50 g/L，FeSO4·7H2O 設為0.05 g/L，MgSO4·7H2O 為0.2 g/L，K2HPO4為0.6 g/L，NaCl 為0.6 g/L，初始pH 調至7.0 條件下稻綠核菌EPS 的得率。從而確定CCD中主效因子蛋白胨的取值范圍。

1.8 中心組合實驗

通過P-B 實驗和單因素實驗，篩選出了稻綠核菌發酵培養基的主效成分葡萄糖和蛋白胨及其取值范圍。在此基礎上利用Expert Design 8.0 軟件進行中心組合設計(Central composite design，CCD)。CCD 實驗中的變量及其水平見表2。

本研究中，采用二因素五水平CCD 實驗進行優化，共設計13 組實驗，各變量及其取值范圍見表7。以X1，X2分別代表葡萄糖和蛋白胨的實際取值，x1、x2代表對應的編碼值。X 與x 之間用以下關系式表示:xi=(Xi-X0)/ △X，i=1、2，xi為Xi的編碼值，X0為Xi的中心點，△X 變量X 取值步長。利用Expert Design 8.0 軟件可以建立EPS 得率為因變量，葡萄糖和蛋白胨為自變量的二次多項式回歸模型，可用如下公式表示:

其中，Y 為目標響應預測值，a0為常數項，x1和x2為自變量;a1和a2為線性相關系數，a3為交互作用相關系數，a4和a5為平方相關系數。

表2 中心組合設計中的變量及其水平Table 2 Values of the variables tested in CCD and their levels

1.9 統計分析

所有的處理均設置三個重復，結果用平均值±標準差表示，并通過SAS version 8.2 軟件進行顯著性差異分析，當P ≤0.05 時，表明各處理間差異達到顯著水平。

2 結果與分析

2.1 多糖的制備

通過搖瓶發酵培養獲得稻綠核菌發酵液，經抽濾，得菌絲和菌液，菌絲經冰凍干燥得203.9 g 干重，將凍干的菌絲粉碎，用于菌絲水提多糖(WPS)和堿提多糖(SPS)的制備。菌液(20 L)用于胞外多糖(EPS)的制備。多糖制備結果見表3。

表3 稻綠核菌多糖的制備Table 3 Preparation of the polysaccharides from V.virens

2.2 多糖的抗氧化活性

一般采用清除自由基的效率和還原能力的大小為檢測指標，從離體或整體水平上衡量多糖抗氧化作用的強弱［16］。本研究對多糖的Fe3+的還原能力和羥基自由基(·OH)清除能力進行了檢測。3 種多糖(WPS、SPS、EPS)對Fe3+還原能力和·OH 清除能力分別見圖1 和表4。如果多糖對Fe3+還原能力越強，反應液在700 nm 處的吸收值就越大，3 種多糖中，胞外多糖(EPS)對Fe3+的還原能力最強，其次是菌絲堿提多糖(SPS)，菌絲水提多糖(WPS)對Fe3+的還原能力最弱(圖1)。

圖1 稻綠核菌多糖對Fe3+的還原能力Fig.1 Fe3+ reducing activity of the polysaccharides from V.virens

EPS 對·OH 表現出較好的清除能力，其EC50值為169.2 μg/mL，優于陽性對照抗壞血酸(EC50值為705.5 μg/mL)。SPS 未檢測出對·OH 的清除能力(表4)。

表4 稻綠核菌多糖清除·OH 自由基的有效中濃度Table 4 Median effective concentration (EC50)of the polysaccharides from V.virens for scavenging ·OH radical.

2.3 生產胞外多糖的培養基優化

2.3.1 培養基主效因子的篩選

為了有效提高稻綠核菌UV-2 胞外多糖(EPS)的得率，根據基本培養基組分(葡萄糖、蛋白胨、硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉)，通過Plackett-Burman 設計，篩選出培養基中影響EPS 生產的主效因子。運用Design-Expert 8.0.6 進行實驗設計(表5)。按該實驗設計配制相應的培養基用于稻綠核菌UV-2 的發酵培養，得到每種培養基中的EPS得率(mg/L)。對實驗所得響應值進行方差分析(表6)，被篩選的7 個因子中，葡萄糖和蛋白胨對稻綠核菌UV-2 的EPS 得率有著較為顯著的影響(P＜0.05)，其它5 個因子(硫酸亞鐵、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈉)對EPS 產率的影響不明顯。因此，葡萄糖和蛋白胨作為主效因子用于后續實驗研究。

2.3.2 單因素實驗

為了進一步篩選出主效因子(葡萄糖和蛋白胨)在中心組合設計(CCD)中的中心點及相應取值范圍，針對葡萄糖和蛋白胨設計單因素實驗，以實現EPS 得率的最大化。

如圖2A 所示，隨著葡萄糖濃度的增加，EPS 的得率呈現先增加后減少的趨勢。當葡萄糖的濃度由40 g/L 梯度增加到80 g/L 時，EPS 的得率呈迅速上升趨勢。當葡萄糖濃度達到80 g/L 的時候，EPS 的得率達到最大值(748.00 mg/L)，隨著濃度進一步增加，EPS 的得率有所下降，但仍處于較高的水平。因此，將葡萄糖的濃度設定在70～90 g/L 范圍內，較有利于稻綠核菌UV-2 胞外多糖的分泌。由此設定CCD 實驗中葡萄糖濃度在中心點水平為80 g/L，“-1”水平和“+1”水平分別為70 g/L 和90 g/L。

表5 Plackett-Burman 實驗設計及其實驗結果Table 5 Plackett-Burman experimental matrix and the results

表6 Plackett-Burman 實驗設計篩選結果的顯著性分析Table 6 Analysis of variance (ANOVA)for responses from the Plackett-Burman screening test

如圖2B 所示，隨著蛋白胨濃度的增加，EPS 的得率呈現先增加后減少的趨勢。當蛋白胨的濃度由5 g/L 梯度增加到15 g/L 時，EPS 的得率呈迅速上升趨勢。當蛋白胨濃度達到15 g/L 的時候，EPS 的得率達到最大值(553.00 mg/L)，隨著濃度進一步增加，EPS 的得率反而有所下降，但還是處于較高的水平。因此將蛋白胨的濃度設定在10～20 g/L 范圍，較有利于稻綠核菌UV-2 胞外多糖的分泌。由此設定CCD 實驗中蛋白胨濃度在中心點為15 g/L，“-1”水平和“+1”水平分別為10 g/L 和20 g/L。

圖2 單因素實驗中葡萄糖(A)和蛋白胨(B)對稻綠核菌胞外多糖得率的影響Fig.2 Effects of glucose (A)and peptone (B)on EPS yield of V.virens in the single-factor experiments

2.3.3 中心組合實驗結果

運用Design-Expert 8.0.6 軟件分析CCD 實驗的數據(如表7 所示)，建立EPS 得率與葡萄糖、蛋白胨之間的二次多項回歸模型。運用該模型可以預測在這兩個變量取值范圍內任意一點所對應的EPS 得率。

用編碼值建立的二次多項式回歸模型如下:

其中Y 為EPS 的得率，x1、x2為葡萄糖(X1)和蛋白胨(X2)相對應的編碼值。

將編碼值轉換成實際值建立的二次多項式回歸模型如下:

運用Design-Expert 8.0.6 對該二次多項式進行方差分析，結果如表8 所示。采用Fisher’s F 檢驗發現，該模型具有較高的F 值(45.91)和極低的P值(＜0.0001)，說明所建立的模型顯著。該模型的決定系數(R2)和校正系數adj-R2近1，說明該模型的相關關系極顯著。該模型的失擬估計Lack of fit經F 分別為0.9735 和0.9434，相對應的相關系數R和adj-R 分別為0.9851 和0.9743，經檢驗，F 值較低，為5.09，p＞F 的概率為0.0752(＞0.05)，說明失擬估計不顯著。此外，該模型的變異系數CV(%)僅為7.11。綜上所述，較高的相關系數，不顯著的Lack of fit，以及較低的CV (%)值說明所建立的二次多項回歸模型合理可靠。比對CCD 實驗中該模型的預測值與實驗值(如表7 所示)之間的關系，發現兩者之間不存在顯著差異，證明該模型具有較好的擬合度。

表7 CCD 實驗及其結果Table 7 CCD experimental matrix and the results

表8 二次多項式模型的方差分析結果Table 8 Analysis of variance (ANOVA)for the fitted quadratic polynomial model

對該二次多項模型的二次項系數進行顯著性分析，結果如表9 所示。采用F 檢驗，所得結果F 值越大，p 值越小，則該二次項對Y 值的影響越顯著。分析結果表明，除二次項“x1x2”(即葡萄糖與蛋白胨之間的交互作用)外，其余二次項對EPS 的得率均具有顯著作用。

2.3.4 響應面分析

圖3 為稻綠核菌胞外多糖EPS 得率隨著變量葡萄糖和蛋白胨濃度的變化而變化的3D 響應面圖和與之相對應的2D 等高線圖。從圖3 中可以看出，葡萄糖和蛋白胨的濃度以及二者之間的交互作用對EPS 得率具有顯著的影響。EPS 的得率隨著葡萄糖和蛋白胨濃度的增加均表現出先上升后下降的趨勢，但葡萄糖和蛋白胨兩者之間的交互作用對EPS 的得率影響不顯著，這一點可以通過2D 等高線圖(圖3B)中心呈較規則的圓形得以推出。3D 響應面圖(圖3A)的最高點即為EPS 得率的最大值點，該點投射到其正下方時位于中心等高線內，即2D 中心等高線范圍內的區域。由此，可以推測出EPS 得率最大時葡萄糖和蛋白胨濃度取值范圍分別為82.5～86.2 g/L 和13.5～15.0 g/L。

2.3.5 稻綠核菌產胞外多糖最佳培養條件的驗證

根據已經建立的二次多項式回歸模型Y=855.20+92.03x1-82.67x2+12.25x1x2-110.04x12-216.54x22 求Y 最大值，可以確定相對應變量x1和x2的取值。預測結果如表10 所示。根據模型，當培養基中葡萄糖的濃度為84.08 g/L，蛋白胨為14.11 g/L 時，EPS 得率達到最大值，為881.40 mg/L。應用模型預測出的最佳培養基進行實驗驗證(n=5)，得到EPS 得率的實驗值為917.80 mg/L，是未優化前(87.00 mg/mL)的10.55 倍。通過t 檢驗對EPS 得率的預測值與實驗值進行顯著性差異分析，發現差異并不顯著。證明該模型具有較高的實際擬合度，可用于指導稻綠核菌EPS 得率的調控。

表9 二次多項式模型的系數及其顯著性分析Table 9 Regression coefficient estimates and their significance test of quadratic polynomial model

圖3 稻綠核菌EPS 得率與葡萄糖和蛋白胨濃度的響應面圖(A)和相應的等高線圖(B)Fig.3 Response surface plot (A)and contour plot (B)of the EPS yield of V.virens versus the tested variables glucose and peptone

表10 稻綠核菌產胞外多糖最佳培養條件和得率Table 10 The optimal cultured conditions for EPS production of V.virens

3 結論

本研究采用Fe3+還原能力和羥基自由基清除能力抗氧化模型對稻綠核菌菌絲水提多糖(WPS)、菌絲堿提多糖(SPS)和胞外多糖(EPS)的抗氧化活性進行了評價，EPS 表現出較好的抗氧化活性，WPS抗氧化活性中等，稻綠核菌多糖的理化性質和其他生物活性(如免疫調節活性等)值得進一步研究。為了有效提高發酵培養液中EPS 的得率，通過Plackett-Burman 設計，篩選出培養基中影響EPS 生產的主效因子為葡萄糖和蛋白胨。通過單因素實驗，確定中心組合設計(CCD)中葡萄糖和蛋白胨濃度的取值范圍分別為70～90 g/L 和10～20 g/L。采用CCD 和響應面分析(RSM)優化了對稻綠核菌EPS 得率具有顯著影響的葡萄糖和蛋白胨的濃度，建立了EPS 得率與這兩個研究變量之間的二次回歸模型。通過求解該模型EPS 得率最大時對應變量的取值，當培養基中葡萄糖濃度為84.08 g/L，蛋白胨濃度為14.11 g/L 時，EPS 得率達到最大值，為881.40 mg/L。應用模型預測出的最佳培養基條件進行實驗驗證(n=5)，得到EPS 得率的實驗值為917.80 mg/L，是優化前(87.00 mg/L)的10.55 倍，且抗氧活性與優化前無顯著性差異(數據未列出)。由于EPS 是分泌到胞外的代謝產物，有利于產物的提取和制備、便于連續培養和降低生產成本等，從而有效促進代謝產物的生產。研究結果為今后培養稻綠核菌大規模生產胞外多糖，以及對稻綠核菌代謝產物綜合開發和利用提供了依據。

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