滁菊揮發油的成分分析及其在卷煙中的應用

徐秀娟 ，王 甜，何保江，李國棟，秦廣雍，屈 展，胡 軍，卓浩廉

1中國煙草總公司鄭州煙草研究院;2 河南中煙工業有限責任公司技術研發中心;3 鄭州大學物理工程學院，鄭州 450000;4 廣東中煙工業有限責任公司技術研發中心，廣州 510385

天然產物分離過程中常用的提取分離技術有水蒸氣蒸餾、樹脂吸附法、超臨界萃取法、亞臨界萃取、分子蒸餾法等［1，2］。水蒸氣蒸餾是提取植物精油最常見的方法，適用于具有揮發性、耐高溫且在水中穩定存在的植物有效組分的提取分離。亞臨界萃取技術是利用亞臨界流體擴散能力強、傳質速度快等特點，將物料中特定極性的成分溶出［3，4］。與超臨界萃取相比，具有條件溫和，工作壓力低，物料不易氧化等優點，因而在天然植物有效成分的提取、天然色素、特種油脂的提取等方面應用廣泛。分子蒸餾是一種在高真空度下進行分離操作的連續蒸餾過程，它是利用不同分子平均自由程的差異導致其表面蒸發速率不同而實現分離［2］。具有蒸餾溫度低、真空度高、物料受熱時間短等優點，在食品、醫藥、日化、香料等領域都有廣泛應用［5］。

滁菊是菊科植物菊的干燥頭狀花序，位居我國四大名菊(滁菊、杭菊、懷菊、亳菊)之首。素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美譽，性溫和，氣味清香。傳統研究認為滁菊具有散風清熱、清肝明目的作用，可用于風熱感冒、頭痛眩暈、眼目昏花等病癥，是藥、食兩用的佳品。部分藥理學研究結果表明，滁菊中含有黃酮、揮發油、多糖、酚酸等多種活性物質，具有很好的應用開發價值［6］。目前，對菊花類凈油的成分分析已有較多報道，菊花凈油中富含萜烯類、醇類、酯類等物質，在卷煙中可凸顯卷煙的清甜香［7-10］。已報道的菊花類凈油均采用水蒸氣蒸餾法，菊花中揮發油因提取方法不同，其化學成分及在卷煙中的效果均會有差異。但目前對不同提取方法所得滁菊凈油揮發性成分的差異性分析，及在卷煙中的應用還未見報道，尤其是通過分子蒸餾的方法制備滁菊凈油還未見報道。本文以滁菊為原料，通過減壓水蒸氣蒸餾、亞臨界萃取技術、分子蒸餾技術制備滁菊凈油，利用氣相色譜-質譜聯用技術分析其化學成分的差異，并對三種凈油在卷煙加香中的效果進行研究，以期為天然煙用香料的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

2013年滁菊1 號樣品(安徽省滁州市滁菊研究所);七匹狼(白)空白卷煙。

丁烷(≥99%，中油化工有限公司);95%乙醇(AR，天津科密歐化學試劑有限公司);乙酸乙酯(AR，天津科密歐化學試劑有限公司);乙酸苯乙酯(99%，阿拉丁試劑(中國)有限責任公司);液氮(河南源正科技發展有限公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

ST-04 多功能粉碎機(浙江省永康市帥通電器廠);7890GC-8975MS 氣質聯用色譜儀(美國安捷倫公司);CBE-5L 型亞臨界提取裝置(河南省亞臨界生物技術有限公司);DLSB-5L/-20 ℃低溫冷卻液循環泵(鄭州長城儀器有限公司);R-210 旋轉蒸發儀(瑞士Buchi);V-700 隔膜真空泵(瑞士Buchi);V-850 真空控制器(瑞士Buchi);分子蒸餾設備KDL 5(德國UIC);CIJECToR 型自動注射加香儀(德國Burghart 公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 減壓水蒸氣蒸餾

稱取滁菊100 g，粉碎至100 目，轉移至2 L 的圓底燒瓶中，加入1000 mL 的沸水，密閉浸泡10 min后冷卻，將滁菊連同浸提物在水浴50 ℃，3 kPa 條件下進行旋轉蒸發。收集到餾分400 mL 后，再次向燒瓶內添加800 mL 沸水，重復上述實驗步驟，待一共收集到1300 mL 餾分后停止蒸餾。用650 mL 乙酸乙酯萃取收集的餾分3 次，合并有機層，在35 ℃，5 kPa 條件下濃縮至10 g，添加100 mL 95%食用乙醇，再次在相同條件下濃縮至10 g，重復添加乙醇3次后，將提取物濃縮得到0.13 g，即為滁菊凈油1#，產率0.13%。

1.2.2 亞臨界萃取

稱取滁菊200 g，粉碎至100 目，裝入5 L 亞臨界萃取釜中，抽真空，注入丁烷，料液比為10∶1，在35 ℃下提取30 min，提取完畢后，將液體溶劑抽進蒸發罐，對物料和浸提液進行脫除溶劑處理，溶劑快速揮發，完成提取物和萃取溶劑的分離，物料分離后再循環提取2 次，合并得到滁菊亞臨界粗提取物15.54 g。由于粗提物中含有蠟質等不溶物，因而采用乙醇回溶、冷凍脫蠟的方法制備凈油。向粗提物中加入10 倍量95%乙醇，并在50 ℃下加熱回溶2 h，待其冷至室溫后于-20 ℃條件下冷凍24 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，得到6.73 g，即為滁菊凈油2#，產率為3.37%。

1.2.3 分子蒸餾

稱取亞臨界萃取所得滁菊凈油80 g，通過分子蒸餾的方法分離輕組分，分子蒸餾條件:壓力10-2mbar，蒸餾溫度為80 ℃，刮板轉速160 rpm，進料速度2.5 mL/min。待進料結束后，收集輕組分即可得到滁菊凈油3#，共得產物11.87 g，產率14.84%，總產率為0.5%。

1.3 滁菊揮發油的GC/MS 分析

分別稱量50 mg 的滁菊凈油，用乙醇溶解定容至10 mL，加入3.280 mg 乙酸苯乙酯作為內標，進行GC/MS 分析，分析條件如下:

色譜柱:DB-5MS 毛細管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm);進樣口溫度:250 ℃;載氣:高純氦氣;流速1.0 mL/min;進樣量:1 μL;分流比10∶1;程序升溫:50 ℃保持1 min，以10 ℃/min 升至200 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 升至260 ℃，保持5 min。

電離方式:EI;離子源溫度:230 ℃;電子能量:70 eV;四級桿溫度:150 ℃;電子倍增器電壓:1.89 kV;質量掃描范圍33～500 amu;掃描方式:全掃描;溶劑延遲:7.0 min。

1.4 定性及定量方法

參考各化合物的保留時間，對每個色譜峰進行譜庫(NIST08 和WILEY)檢索，確定滁菊揮發油的各化學成分;對于鑒定出的成分，以乙酸苯乙酯為內標，采用“單一內標校正法”進行定量，假定相對校正因子為1，含量按以下公式計算:

式中:Ms—內標乙酸苯乙酯的質量(mg);Mi—i組分所屬的凈油的質量(mg);Ai—i 組分的峰面積;As—內標乙酸苯乙酯的峰面積。

1.5 加香［11］與評吸

挑選重量和吸阻均勻一致的七匹狼(白)空白卷煙樣品，用自動注射加香儀分別將質量濃度為1%的滁菊凈油1#、2#、3#(95%食用乙醇稀釋)注入空白卷煙中，注射量2 μL/支，開始和結束注射點距煙絲端分別為5 mm 和55 mm。注射完畢后，將卷煙裝入煙盒中，密封于22±2 ℃和RH 60%±5%條件下放置1 周。請專業人員分別從香氣質、香氣量、雜氣、刺激性和余味等方面對加香效果進行評價，對照樣煙為加入等量95%食用乙醇的七匹狼(白)空白卷煙。

2 結果與討論

2.1 三種滁菊凈油成分分析

按照上述GC/MS 條件對不同方法制備的滁菊凈油進行分析，通過檢索標準譜庫(NIST08 和WILEY275)及人工解析圖譜相結合的方式確定化合物，所得分析結果如表1 所示。三種凈油中共鑒定出79 種化學成分，主要包括有機酸類8 種、酮類14種、醇類18 種、烯烴類25 種、酯類7 種，以及其他化合物等。制備方法不同，所含成分數目及種類略有差異，其中減壓水蒸氣蒸餾共鑒定出65 種化合物，亞臨界萃取和分子蒸餾分別鑒定出60 和63 種，三種凈油中共有的成分有47 種。從表1 中可見，滁菊凈油中含量較高的是龍腦、β-芹子烯、β-倍半水芹烯、(E)-β-金合歡烯、蒿酮、馬兜鈴環氧化物等，這與文獻報道的結果相一致［12］。

醇類物質中含有龍腦、桃金娘烯醇、α-紫羅蘭醇、檀香醇、二氫芳樟醇、2-乙基己醇、橙花叔醇、桉油烯醇、2-羥基桉樹腦、α-松油醇等，其中龍腦、桃金娘烯醇具有清涼的、薄荷的藥草氣息;檀香醇具有甜而溫和的木香，且香氣持久;α-松油醇能與煙草的香味協調，賦予果香與辛香，改善煙氣;橙花叔醇在煙草中可增加蜜甜、花香、果香的香韻，改善吃味［7］。烯烴類共25 種，占總揮發物質的32.87%～44.22%，包括β-芹子烯、α-姜黃烯、(E)-β-金合歡烯、β-倍半水芹烯、α-蒎烯、月桂烯、長葉烯、β-甜沒藥烯等，在卷煙中可能具有抗氧化或抑制煙氣自由基的作用［10］。α-蒎烯具有松木、針葉及樹脂樣的氣息，香氣透發;(E)-β-金合歡烯具有特殊的青香韻的鈴蘭花香氣，并伴隨有木香香韻［13］;β-甜沒藥烯具有愉悅的甜香、花香氣息［14］。酮類物質的含量僅次于烯烴類和醇類，占總揮發物的7.19%～12.86%，其中的樟腦、菊油環酮、植酮、香芹艾菊酮等在文獻中已有報道［12］，是菊花揮發油中常見的酮類化合物，樟腦具有竄透性的特異芳香;6-甲基-5-庚烯-2-酮具有強烈的青香、柑橘樣的香氣，在卷煙中可修飾果香，增添清香，烘托上等煙獨具的風味。滁菊凈油中有機酸的含量相對較少，且幾乎僅存在于1#凈油中，異丁酸、異戊酸等能在煙草制品中增添水果和乳酪樣甜香，使煙氣醇和，增強香料煙的風格。酯類化合物中的乙酸薄荷酯、乙酸葉醇酯、乙酸龍腦酯等均可增強煙草制品的清香，緩和煙氣吸味，掩蓋刺激性。此外，鑒定出的化合物中還含有少量的2，3，4，5，-四甲基吡嗪、石竹素、馬兜鈴烯環氧化物等。從以上分析可見，滁菊凈油中的多種成分可能具有增強卷煙香氣、降低煙氣刺激性、改善吸味等作用。

表1 滁菊凈油的GC/MS 分析結果Table 1 GC/MS analysis results of Chrysanthemum morifolium volatile oils

減壓水蒸氣蒸餾、亞臨界萃取和分子蒸餾的得率分別為0.13%、3.37%、0.5%，1#凈油為黃色透明液體，2#凈油為墨綠色粘稠油狀物，3#凈油為黃綠色澄清透明液體，三者均具有濃郁的菊花香氣和藥草香。亞臨界萃取的產率最高，這是因為以丁烷為萃取溶劑時，萃取物中不僅含有易揮發性物質，同時也包含部分大分子物質。經分子蒸餾之后，在一定的蒸餾溫度及壓力下，不易揮發、分子平均自由程較小的物質集中在重組分中，輕組分中高沸點物質的含量大大降低，因而3#凈油的產率也大大降低。減壓水蒸氣蒸餾只提取植物中的低沸點、易揮發物質，提取物中幾乎無非揮發大分子物質，而植物中的揮發油含量本身較少，因此，1#凈油的產率最低。

制備方法不同，所得凈油中揮發性物質的種類及含量差異較大。如表2 所示，三種凈油鑒定出的揮發物總量分別為 22.080%、3.1654%、14.1987%。減壓水蒸氣蒸餾的總量最高，而亞臨界萃取的總量最低。這是因為，水蒸氣蒸餾是將植物中的揮發性成分隨水蒸氣一并餾出，經冷凝后收集，半揮發或難揮發物質的含量極低，而亞臨界萃取物中仍含有大量高沸點物質，因此1#凈油中鑒定出的物質種類最多，且總量也最多，而2#凈油中鑒定出的物質種類及含量最低。3#凈油是在2#的基礎上，采用分子蒸餾，在80 ℃的蒸餾溫度下，對其中的輕組分進行富集，有效降低了高沸點物質的含量，因而其含量較2#有明顯提高。

表2 三種凈油中各類化合物的總含量Table 2 The content of different compounds in the volatile oils

圖1 三種凈油中各類成分的含量對比Fig.1 Content comparison of different compounds in the volatile oils

三種凈油中烯烴類、醇類和酮類的含量均較高，此外還含有部分有機酸、烷烴、雜環化合物等，但制備方法不同各類物質的變化規律略有差別。如圖1所示，2#和3#凈油中各類物質的含量從高到低分別為烯烴類、醇類、酮類、其他類、酯類和有機酸類，其變化規律一致。其原因在于，亞臨界萃取適用于天然產物分離的前階段，即從原料中萃取有效物質，而分子蒸餾是將粗產品中的有效成分進行分離提純，本身不能用于前期的提取。本實驗中分子蒸餾所用粗產品即為2#凈油，因此，在物質組成上2#與3#差異較小，但是從物質含量上來看，3#凈油中揮發性物質的含量大大提高，例如:2-羥基桉樹腦的含量是分離前的13.93 倍;(E)-β-金合歡烯的含量從0.06579%增加到0.71062%，同時也高于1#凈油中的含量(0.48145%);滁菊揮發油的主要成分龍腦、β-芹子烯也從原來的0.61%增加到2.7%左右;此外，分離純化后，3#凈油中還鑒定出了菊油環酮、乙酸異龍腦酯和香橙烯環氧化物，其中，菊油環酮是菊花中常見的芳香物質，已有報道該物質存在于安徽產菊花中［12］。1#凈油中醇類物質的含量明顯增高，各物質的含量從高到低依次為醇類、烯烴類、酮類、有機酸類、酯類和其他類。這是因為，丁烷為弱極性溶劑，根據相似相溶原理，該溶劑對極性較大的醇類、有機酸類的萃取率相對較低，對極性較弱的烯烴類萃取效率較高;水蒸氣蒸餾是根據共沸原理，將易揮發性物質與水共沸而帶出，與物質的極性無關，因而1#凈油中醇類、酸類的含量均有增加。由表1 可見，1#凈油中有機酸的含量明顯增高，鑒定出了異丁酸、異戊酸、正己酸、反式-2-甲基-2-丁烯酸等，這些物質的沸點較低，極性較大，因而只存在于水蒸氣蒸餾所得凈油中。此外，1#凈油中龍腦的含量高達11.121%，乙酸龍腦酯的含量為0.32293%，使得醇類和酯類的含量顯著增加。

表3 三種凈油在空白煙支上的加香效果Table 3 Evaluating the effect of three volatile oils on reference cigarettes

2.2 三種滁菊凈油的卷煙加香結果評價

卷煙加香評吸結果如表3 所示，三種凈油均能較好的提高香氣質、增加香氣量，煙氣柔和細膩，但在減輕殘留和刺激性方面作用較小。1#凈油對殘留有明顯改善，這可能與凈油中多為易揮發香味物質，無大分子物質有關;2#凈油中除揮發、半揮發物質外，還有較多的高沸點物質，因而口感較差，余味較差;3#凈油通過分子蒸餾之后，大分子物質的含量大大降低，因而口感比2#有較大改變。總體而言，滁菊凈油能夠一定程度上提高香氣質和香氣量，柔和煙香，掩蓋雜氣，使得煙氣細膩。

3 結論

采用減壓水蒸氣蒸餾、亞臨界萃取和分子蒸餾三種方法，制備了滁菊凈油，經GC/MS 分析共鑒定出79 種化學成分，主要包括有機酸類8 種、酮類14種、醇類18 種、烯烴類25 種、酯類7 種，以及其他化合物等。以烯烴類和醇類為主，其中含量較多的是龍腦、β-芹子烯、β-倍半水芹烯、(E)-β-金合歡烯、蒿酮、馬兜鈴環氧化物等，正是這些物質的有機結合，才構成了滁菊的特征香氣。三種方法相比，減壓水蒸氣蒸餾能夠更好的提取滁菊中的龍腦、有機酸類和酯類等香味成分;亞臨界萃取對天然植物中的弱極性物質有較好的提取效果，對強極性物質的提取效果略差;分子蒸餾能夠降低凈油中高沸點物質的含量，富集易揮發和半揮發物質，有效提高烯烴類和醇類的含量。卷煙加香結果表明，滁菊凈油具有提高香氣質，增加香氣量，使得煙氣細膩柔和，掩蓋雜氣等作用，是一種理想的天然煙用香原料。

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