通氣量對靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜的影響

馮 杰，馮 娜，楊 焱，劉 方，賈 薇，張勁松

國家食用菌工程技術(shù)研究中心農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403

靈芝(Ganoderma lucidum)是擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝菌屬真菌，是中國傳統(tǒng)的藥用真菌，具有悠久的藥用歷史。靈芝的關(guān)鍵藥效成分是靈芝多糖和靈芝三萜［1］。靈芝三萜具有消炎止痛、鎮(zhèn)靜、解毒、保肝、抗艾滋病病毒、抗腫瘤、保肝作用，抑制組胺釋放、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶等功能，是靈芝發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［2，3］。

作為靈芝類的主要化學(xué)成分之一，靈芝三萜類化合物吸引了越來越多研究者的關(guān)注。現(xiàn)階段獲取靈芝三萜材料的方法有3 種，一是野外子實體或人工栽培的子實體，二是靈芝孢子，三是液體發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液。與人工栽培靈芝相比，通過液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝三萜具有菌絲增殖速度快，不受季節(jié)影響、生產(chǎn)周期短、三萜類含量相對穩(wěn)定等特點，現(xiàn)成為獲取靈芝三萜的最有效方法［4，5］。盡管經(jīng)過幾十年來的努力，液體發(fā)酵靈芝生產(chǎn)靈芝三萜已取得不少成果，但是到目前為止，靈芝三萜的產(chǎn)量仍然不能滿足其應(yīng)用的需求。

近年來，靈芝液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜的產(chǎn)量受到廣泛的關(guān)注，由于它們所具有的各種生理活性物質(zhì)，目前更多的研究集中在其藥理應(yīng)用［3］。很多研究集中在靈芝菌絲體搖瓶發(fā)酵的影響因素，如培養(yǎng)基配方優(yōu)化、培養(yǎng)條件的選擇等方面［4，6，7］。但是靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵的擴大培養(yǎng)目前還很少有報道。上海交通大學(xué)鐘建江等［4，7］對真菌靈芝發(fā)酵生產(chǎn)靈芝多糖和菌絲體中靈芝三萜酸作了較為深入的研究，涉及發(fā)酵培養(yǎng)基組成、環(huán)境因素的優(yōu)化，發(fā)酵動力學(xué)研究及流加發(fā)酵，兩段法靜置培養(yǎng)等方面。他們在研究中發(fā)現(xiàn)，高的體積溶氧傳質(zhì)系數(shù)對菌球形態(tài)有較大影響，或使培養(yǎng)物中大的菌球數(shù)目增多，或使菌球直徑相對增加，從而引發(fā)“氧限制”現(xiàn)象，而這卻有利于單位細胞靈芝酸的大量合成。因此選取發(fā)酵過程中的溶氧關(guān)鍵點加以控制或改變，可能會顯著改變原有發(fā)酵結(jié)果。

在擴大培養(yǎng)中影響靈芝三萜合成的因素很多，其中通氣量等影響較為顯著［5］。由于靈芝菌絲體在培養(yǎng)過程中粘度很大，對氧需求也很大［8-10］。因此為了滿足在培養(yǎng)過程中菌球能緊密生長，提高傳質(zhì)系數(shù)，有必要對考慮靈芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中的操作條件進行研究。基于以上分析，本研究采用5 L 攪拌式發(fā)酵罐研究靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜的擴大培養(yǎng)條件，考察了4 種條件下的通氣量對靈芝菌絲體生長、靈芝三萜合成、還原糖消耗、以及銨根離子消耗的影響。以期得出較佳的操作條件，為靈芝菌絲體的工業(yè)放大生產(chǎn)提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株滬農(nóng)靈芝1 號由中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心上海食用菌分中心提供，菌株編號:Ganoderma lucidum G0119。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):去皮馬鈴薯200 g，加1000 mL 蒸餾水煮沸后，過濾，加入葡萄糖20 g，瓊脂25 g，補加蒸餾水至1000 mL，121 ℃滅菌25 min 后備用。

種子培養(yǎng)基(g/L):去皮馬鈴薯200 g，加1000 mL 蒸餾水煮沸后，過濾，加入20 g 葡萄糖，補加蒸餾水至1000 mL，攪拌均勻，121 ℃滅菌25 min 后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30，氯化銨3.5，七水硫酸鎂2，磷酸二氫鉀2，調(diào)節(jié)pH 至5.50，121 ℃滅菌25 min 后備用。發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖，七水硫酸鎂和磷酸二氫鉀組成由前期研究獲得，請見參考文獻［11］。其中氯化銨濃度根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定其濃度為3.5 g/L。

1.3 主要設(shè)備

發(fā)酵罐:上海保興生物設(shè)備工程有限公司BIOTECH-5BGZ-50JS 5 L 發(fā)酵罐。

酶標(biāo)儀:美國Bio-Tek 公司BioTek-Synergy HT多功能酶標(biāo)儀。

1.4 培養(yǎng)條件

菌種活化:挑取冷凍管保藏菌種于斜面培養(yǎng)基中，26 ℃恒溫箱倒置培養(yǎng)15 d 后置于4 ℃冰箱待用和保藏。

種子培養(yǎng):將已活化的斜面菌種接種于裝有100 mL 液體種子培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中，在150 rpm，26 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)10 d，制得種子液。

發(fā)酵罐培養(yǎng):將制備好的種子液轉(zhuǎn)接至5 L 發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)。其中，接種量10%，發(fā)酵罐裝液量4 L，攪拌轉(zhuǎn)速100 rpm，培養(yǎng)溫度26 ℃［11］，通氣量分別4，6，8，10 L/min，培養(yǎng)至還原糖和銨根離子濃度無明顯變化結(jié)束發(fā)酵。

1.5 分析方法

菌體濃度的測定:取發(fā)酵液100 mL 在10000 rpm 下離心10 min 棄上清液，后取沉淀用去離子水洗滌3 次，收集后放在60 ℃的烘箱中烘干至恒重，精確稱重。

還原糖含量的測定:取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液，采用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖濃度［12］。

銨根離子含量的測定:取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液，采用水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法測定氯化銨中銨根離子濃度［13］。

靈芝三萜含量的測定:齊墩果酸比色法［14］。

1.6 動力學(xué)參數(shù)的計算

不同通氣量條件下菌絲體比生長速率，還原糖和銨根離子比消耗速率，靈芝三萜比合成速率根據(jù)參考文獻［15］計算得出。用Origin 8.5 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行插值計算并求解出不同通氣量條件下的比速率值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.5 軟件和SPSS 20.0 數(shù)據(jù)處理軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 通氣量對靈芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中菌絲體生長的影響

通氣量對靈芝菌絲體生長、產(chǎn)物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變菌絲體對溶解氧攝取的環(huán)境，而且會影響菌絲體代謝過程中各種關(guān)鍵酶的活性。通氣量對菌絲體液態(tài)發(fā)酵的影響是各種因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果，因此在菌絲體液態(tài)發(fā)酵過程中必須保證穩(wěn)定而合適的溶氧環(huán)境，即穩(wěn)定和合適的通氣量。

如圖1 所示的在不同通氣量條件下，靈芝菌絲體的生長變化情況。由圖1 分析可知，從4 L/min通氣量到10 L/min，靈芝菌絲體干重呈現(xiàn)規(guī)律性變化。在4 L/min 和6 L/min 通氣量條件下，菌絲體生長的遲滯期約在0 h 到100 h 之間，在100 h 后進入對數(shù)期，在200 h 前后進入穩(wěn)定期，達到最大菌絲體含量。而在8 L/min 和10 L/min 條件下，菌絲體的遲滯期相對較短，在48 h 前后即進入對數(shù)期，約在100 h 前后進入穩(wěn)定期。在8 L/min 通氣量條件下，最大菌絲體干重為8.77 g/L，比4L/min、6 L/min 和10 L/min 通氣量條件下分別提高44.48%、34.51%和15.09%。

再如圖1 所示在不同通氣量條件下，靈芝菌絲體的比生長速率也呈現(xiàn)規(guī)律性變化。比生長速率是指每小時單位質(zhì)量的菌絲體所增加的菌絲體量稱為菌絲體比生長速率。它是表征微生物生長速率的一個參數(shù)，也是發(fā)酵動力學(xué)中的一個重要參數(shù)。比生長速率值越大，表明菌絲體的生長活力越大。在4 L/min 至10 L/min 通氣量范圍內(nèi)，在8 L/min 條件下菌絲體最早達到最大比生長速率，依次分別為10 L/min，4 L/min 和6 L/min 條件。分析原因可能是靈芝菌絲體作為好氧真菌的典型代表，其生長過程與溶解氧濃度密不可分，在適當(dāng)范圍內(nèi)，溶解氧濃度越大，即通氣量越大，越有利于菌絲體的生長。且較高的溶解氧濃度促使菌絲體的生長代謝加快，較早進入對數(shù)生長期，其比生長速率也是較早達到最大值。

圖1 不同通氣量下菌絲體生長和比生長速率的變化情況Fig.1 Time curves of mycelial growth and specific mycelial growth rate under different aeration rates

2.2 通氣量對靈芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中還原糖含量的影響

不同通氣量對菌絲體消耗還原糖有較大差別的影響。由圖2 分析可知，隨著菌絲體的快速生長，還原糖的消耗也逐漸加快，通氣量越大消耗還原糖的速率也越快，這與菌絲體的生長趨勢是保持一致的。在8 L/min 條件下，還原糖消耗速率最快，還原糖的最終濃度為7.5 g/L，利用率為74.98%，相比較于其他條件下的利用率分別提高了56.24%、46.28%和23.92%。通氣量加大，發(fā)酵液中還原糖消耗的更為徹底，與靈芝菌絲體的增加相對應(yīng)。

不同通氣量條件下還原糖的比消耗速率變化也很明顯。比消耗速率指的是單位時間內(nèi)單位菌體消耗基質(zhì)的量。比消耗速率反應(yīng)的是菌絲體對底物利用快慢的物理量。由圖2 分析可知，在較為適中的通氣量8 L/min 的條件下，發(fā)酵液中還原糖的比消耗速率最大，與之對應(yīng)的比生長速率也最快。在不同通氣量條件下最大還原糖比消耗速率分別為0.0679 1/h、0.0714 1/h、0.562 1/h 和0.176 1/h。在8 L/min 條件下，還原糖比消耗速率也較早達到最大值，對于菌絲體生長和靈芝三萜的合成是有利的。同時，在8 L/min 條件下，發(fā)酵后期發(fā)酵液中的溶氧仍然保持較高的濃度，因此在較大的通氣量下， 靈芝菌絲體生長較為充分。

圖2 不同通氣量下還原糖含量和還原糖比消耗速率的變化情況Fig.2 Time curves of reducing sugar consumption and specific reducing sugar consumption rate under different aeration rates

2.3 通氣量對靈芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中銨根離子含量的影響

由圖3 可見，發(fā)酵液中初始氯化銨的理論濃度為3.5 g/L，即銨根離子理論濃度為1.18 g/L。進入對數(shù)生長期的靈芝菌絲體迅速分解氮源，吸收營養(yǎng)物質(zhì)，致使銨根離子濃度迅速下降，在4 L/min 和6 L/min 通氣量條件下，發(fā)酵至240 h 銨根離子濃度保持穩(wěn)定，直至發(fā)酵結(jié)束整個體系中銨根離子含量始終保持在較高的水平。在8 L/min 和10 L/min通氣量條件下，發(fā)酵至156 h 銨根離子濃度保持穩(wěn)定，直至發(fā)酵結(jié)束整個體系中銨根離子含量始終保持在較低的水平，尤其在8 L/min 通氣量條件下，最終銨根離子的含量達到0.22 g/L，為所有條件下最低。

再由圖3 分析可知，隨著菌絲體的快速生長，銨根離子的消耗也逐漸加快，通氣量越大消耗銨根離子的速率也越快，這與菌絲體的生長趨勢是保持一致的。在較為適中的通氣量8 L/min 的條件下，發(fā)酵液中銨根離子的比消耗速率最大，與之對應(yīng)的比生長速率也最快。在不同通氣量條件下最大銨根離子比消耗速率分別為0.00293 1/h、0.00390 1/h、0.0171 1/h 和0.00185 1/h。在8 L/min 條件下，銨根離子比消耗速率也較早達到最大值，對于菌絲體生長和靈芝三萜的合成也是有利的。

圖3 不同通氣量下銨根離子含量和銨根離子比消耗速率的變化情況Fig.3 Time curves of ammonium consumption and specific ammonium consumption rate under different aeration rates

2.4 通氣量對靈芝液態(tài)深層發(fā)酵過程中靈芝三萜合成的影響

由圖1 和圖4 可見，液態(tài)深層發(fā)酵過程中靈芝三萜的積累與菌絲體的生長屬于部分生長偶聯(lián)型。在菌絲體處于對數(shù)生長期時，靈芝三萜合成速率較慢;當(dāng)菌絲體生長進入穩(wěn)定期時，菌絲體干重的增長趨勢減慢，菌絲體濃度保持在一個較穩(wěn)定的水平，而靈芝三萜的合成速率卻有明顯的提高。由圖4 可知，通氣量在4 L/min 至10 L/min 之間，隨著通氣量的提高靈芝三萜得率也在不斷增加，通氣量為8 L/min 時，靈芝三萜得率最大，達到2.33 mg/100 mg菌絲體，比4 L/min、6 L/min 和10 L/min 通氣量條件下的靈芝三萜得率分別提高了1.39 倍、0.99 倍和0.84 倍，達到最大比合成速率0.0256 1/h 時，所用的時間最短，為70 h。由此可見，高通氣量對于菌絲體生長和靈芝三萜的合成都有明顯的促進作用。

再由圖4 可以得出，通氣量在4 L/min 至10 L/min 之間，達到最大比合成速率的時間分別為118、81、70、108 h，當(dāng)通氣量為8 L/min 時，比合成速率的增幅最大，且達到最大比合成速率的時間最短，而合成靈芝三萜的時間相對其他通氣量條件也是最短的。綜合比較靈芝三萜得率、比合成速率以及發(fā)酵周期情況，通氣量在4 L/min 至10 L/min 內(nèi)，8 L/min 為最佳通氣量。

圖4 不同通氣量下靈芝三萜合成和比合成速率的變化情況Fig.4 Time curves of triterpenes production and specific triterpenes production rate under different aeration rates

2.5 通氣量條件下各動力學(xué)參數(shù)變化的比較

將圖1、圖2、圖3 和圖4 中實驗數(shù)據(jù)進行整理，得到不同通氣量條件下靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過程參數(shù)，如表1 所示。在整個發(fā)酵過程中，通氣量對不同參數(shù)的影響是有差異的，甚至是相反的。其中，菌絲體平均比生長速率和靈芝三萜平均比合成速率在8 L/min 條件下達到最大值，分別為18.75 ×10-31/h 和7.02 ×10-31/h，而最大菌絲體干重，靈芝三萜得率，菌絲體生產(chǎn)強度和靈芝三萜生產(chǎn)強度也是在同一條件下達到最高值。由此可見，菌絲體生長和靈芝三萜的合成是同步的。因此，在菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過程中在適當(dāng)?shù)耐饬糠秶鷥?nèi)，高的通氣量利于菌絲體的生長和靈芝三萜的合成。

表1 不同通氣量條件下的靈芝菌絲體發(fā)酵參數(shù)比較Table 1 Fermentation parameters in different agitation rates

注:生產(chǎn)強度定義為單位時間單位體積的菌絲體或靈芝三萜的生產(chǎn)量，單位g/(L·h)。Note:Productivity was defined as the producing amount per one litre and one hour，the unit was g/(L·h).

3 結(jié)論

在靈芝菌絲體培養(yǎng)過程中，溶氧濃度是一個非常關(guān)鍵的控制參數(shù)，氧的適度供給是保證菌絲體良好生長和代謝產(chǎn)物高產(chǎn)的必要條件，特別是對絲狀真菌發(fā)酵的影響尤為明顯，其中通氣量對發(fā)酵液的溶氧濃度起到直接的作用。

通氣量在靈芝菌絲體發(fā)酵過程中主要起著混合和調(diào)節(jié)溶氧的作用，影響著菌絲球的大小，包括影響菌絲纏繞成球或打碎菌絲球，發(fā)酵過程中通氣量作用對菌絲球尺寸的影響，間接地影響菌球內(nèi)氧及底物的消耗，同時對靈芝三萜的合成都有直接的影響，但是由于靈芝菌絲體對通氣量敏感，過高或過低的通氣量使菌絲體量、菌體形態(tài)以及靈芝三萜的合成發(fā)生一定的變化。

本實驗通過考察通氣量對靈芝菌絲體液態(tài)發(fā)酵過程中合成靈芝三萜的影響，研究發(fā)現(xiàn)，通氣量在4 L/min 至10 L/min 之間，8 L/min 為最優(yōu)通氣量。在此條件下，靈芝三萜的生產(chǎn)強度最大，達到0.00131 g/(L·h)，靈芝三萜得率最大，達到0.204 g/L，菌絲體的最大菌濃達到8.77 g/L，實現(xiàn)了液態(tài)深層發(fā)酵靈芝三萜的高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)強度的統(tǒng)一。同時菌絲體對碳源(葡萄糖)和氮源(氯化銨)的利用率也最高，分別為74.97%和78.22%，對底物較高的利用率促進了菌絲體生長和靈芝三萜的合成。過高或者過低的通氣量對菌絲體的生長，對底物的利用和對靈芝三萜的合成均不利。通過研究通氣量對靈芝菌絲體液態(tài)發(fā)酵過程中合成靈芝三萜的影響，確定出較佳的通氣量條件，可以為后續(xù)的研究提供基礎(chǔ)，同時為生產(chǎn)的擴大化提供更好的參考。

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