響應面法優化忽地笑多糖提取工藝及石蒜屬植物多糖含量比較研究

劉小攀，田春蓮，姚姝鳳，董愛文，田啟建

吉首大學林產化工工程湖南省重點實驗室，張家界 427000

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結構復雜且龐大的糖類物質，植物多糖是多糖的重要組成部分。大量的藥理與臨床研究證明，植物多糖具有抗腫瘤、防衰老、抗病毒、免疫、抗氧化、降血糖、降血脂等多種藥理作用，尤其是一種高效免疫調節劑，它能激活免疫細胞而對正常細胞無毒副作用，目前已廣泛應用于醫藥保健品行業［1-8］。石蒜屬植物雖富含生物堿、多糖和及黃酮類化合物［9-11］，但目前研究熱點是石蒜生物堿及藥理活性［12］，石蒜多糖作為燃料酒精［13］有報道，多糖提取僅見于吳彥等［14］的研究，但未優化工藝且提取率低。石蒜屬植物全世界約20 余種，我國有15 種，主要分布于長江以南，尤以溫暖地區種類較多［15］。湖南湘西地區石蒜屬植物主要有忽地笑［Lycoris aurea (L’Her.)Herb.］、中國石蒜(Lycoris chinensis Traub)、稻草石蒜(Lycoris straminea Lindl.)、石蒜［Lycoris radiata(L’Her.)Herb.］和玫瑰石蒜(Lycoris rosea Traub et Moldenke)等，其藥用價值未能得到深度開發。因此，本研究立足當地資源，運用響應面分析軟件優化了石蒜多糖傳統水提的工藝條件，并比較了忽地笑等五種石蒜屬植物的不同營養器官的多糖含量，旨在獲得石蒜多糖低成本、高得率的綠色提取工藝，篩選出高石蒜多糖含量的種質資源，為綜合開發石蒜，進一步提高石蒜深加工的附加值提供基礎數據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

忽地笑等實驗材料采自吉首大學張家界校區后山石蒜栽培基地，經吉首大學廖博儒研究員鑒定為石蒜科石蒜屬植物忽地笑、中國石蒜、稻草石蒜、石蒜及玫瑰石蒜。葡萄糖標準品(批號:130410-1)購自西隴化工股份有限公司;蒽酮、濃硫酸、無水乙醇和石油醚均為分析純;實驗用水為去離子水。

1.2 儀器

AEL-40SM 十萬分之一分析天平(日本島津公司);UV-3900 型紫外可見分光光度計(日本日立公司);數顯恒溫水浴箱(金壇市富華儀器有限公司);TDL-40B 低速臺式大容量離心機(上海安亭科學儀器)。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

分別將忽地笑、中國石蒜、稻草石蒜、石蒜和玫瑰石蒜的根莖葉洗凈，干燥，粉碎，過40 目篩，稱取一定量的各樣品加入一定量石油醚浸泡24 h，然后用一定量95%乙醇浸泡24 h，以除去其中的脂溶性物質及部分色素，將殘渣45 ℃烘干，備用。

1.3.2 忽地笑多糖的提取

準確稱取經處理的忽地笑鱗莖粉末2.0 g 于50 mL 錐形瓶中，加入一定量的水，于一定溫度下水提，提取液4000 rpm 離心10 min，過濾，定容至100 mL，得忽地笑粗多糖溶液。根據蒽酮-硫酸法測定吸光度，計算忽地笑多糖含量。

1.3.2.1 單因素實驗設計

以忽地笑多糖得率為指標，按照1.3.2 的方法，在一定條件下，分別考察液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 和30∶1(mL∶g);提取溫度55、65、75、85、95℃;提取時間3、4、5、6、7、8 h，對忽地笑多糖得率的影響。

1.3.2.2 響應面實驗設計

為進一步得出忽地笑多糖最佳提取工藝和綜合考察各因素的交互影響，在單因素實驗基礎上，根據Box-Benhnken 實驗設計原理，設計三因素三水平的響應面分析實驗(表1)。以提取溫度(A)、液料比(B)、提取時間(C)為自變量，以忽地笑多糖得率為響應值，通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件，對提取工藝進行響應面分析。求出數學模型，得到最佳工藝參數。

表1 Box-Benhnken 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.3.3 標準曲線的繪制

參照文獻［16］并改進，稱取105 ℃真空干燥至質量恒定的葡萄糖50 mg，用去離子水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，制成0.5 mg/mL 葡萄糖溶液。分別取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于50 mL 容量瓶中，去離子水定容至刻度。各取以上6 組溶液2 mL 于50 mL 錐形瓶中，冰水中加入0.2%的蒽酮-硫酸試劑(80%的濃硫酸)8 mL，搖勻，沸水浴10 min，冷卻至室溫，于625 nm 處測吸光度(A625)，以2 mL去離子為空白。以葡萄糖濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，得回歸方程A=9.285C +0.004，r=0.9995，在0.01～0.10 mg/mL 之間葡萄糖對照品濃度與吸光度呈良好的線性關系。

1.3.4 忽地笑多糖得率計算

采用蒽酮-硫酸法測定忽地笑中多糖的含量，根據實驗所得回歸方程A=9.285C+0.004，r=0.9995 計算樣品中多糖的含量，從而得到每個實驗組鱗莖中多糖得率，忽地笑多糖得率計算公式如下:

式中:C 為忽地笑粗多糖質量濃度(mg/mL);X為稀釋倍數;M 為忽地笑鱗莖粉末質量/g;y 為忽地笑多糖得率/%。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響

液料比是提取忽地笑多糖的一個很重要因素。結果如圖1(a)，液料比在10∶1～20∶1 (mL∶g)內，多糖得率隨液料比的增加而上升，當液料比達到20∶1(mL∶g)時多糖得率達到最高，之后隨液料比的增加多糖得率逐漸下降。這可能是由于隨著液料比的增加，多糖在水溶劑中逐漸達到飽和，再增大溶劑的體積，易提取出大量的雜質而且不利于后續的處理。所以，選最佳液料比為20∶1(mL∶g)。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響

由圖1(b)可知，在55～75 ℃內，隨著溫度的升高，多糖得率逐漸上升，75 ℃時達最大值，然后隨浸提溫度升高多糖得率逐漸降低，可能由于溫度過高導致多糖的分子結構遭到破壞，故選取75 ℃為宜。

2.1.3 提取時間對多糖得率的影響

據圖1(c)所知，忽地笑多糖得率在3～7 h 內隨提取時間延長而增加，7 h 時達最大，超過7 h 多糖得率急劇下降。可能由于隨著時間的延長，忽地笑粉末得到充分的浸泡而有利于多糖的溢出，超過一定時間后多糖發生水解而使提取率下降。因此，選取提取時間7 h。

圖1 液料比(a)、提取溫度(b)、提取時間(c)對忽地笑多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid/solid ratio (a)，extraction temperature (b)，extraction duration (c)on extraction yield of L.aurea polysaccharides

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗分析

通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表2 中實驗結果進行回歸擬合分析，經二次回歸擬合后得回歸方程:Y=42.01-0.50A +0.39B +0.29C-0.59AB-1.06AC-0.18BC-1.53 A2-0.44 B2-0.54 C2。

表2 Box-Benhnken 設計方案及結果Table 2 Box-Benhnken design and experimental results

方差分析結果見表3。從表3 可知，較高的F值(45.53)和較低的P(＜0.0001)表明Quadratic 回歸方差模型極其顯著，模型的確定系數R2=0.9832，接近1，說明其因變量與全體自變量之間的多元回歸關系顯著，真實值與預測值之間有很好的相關性，回歸方程能夠很好地模擬真實曲面，該實驗方法是可靠的。模型的調整系數=0.9616，這就意味著該模型能預測大部分(＞96%)多糖提取率的變化，只有不到4%不能通過該模型去解釋。因而該模型擬合程度良好，實驗誤差小。失擬項是用來評估方程可靠性的一個重要數據，本實驗失擬項F 值為1.77，P 值為0.2914＞0.05，說明該模型失擬項不顯著，能很好地預測相關的反應。另外，實驗變異系數C.V.%越小表明實驗越可靠，本實驗的變異系數C.V.%為0.58，說明實驗值精密度高，可靠。因此，可用該模型方程來分析和預測不同提取條件下忽地笑多糖得率的變化。

P 值是用來檢測每個變量以及變量之間的顯著水平，P 值越小，說明變量對實驗的影響越顯著，由表3 可知A、B 和C 對忽地笑多糖得率都有顯著影響，且影響順序為:A＞B＞C;二次項A2、B2和C2對忽地笑多糖得率也有顯著影響，且A2對忽地笑多糖得率有極顯著影響(P＜0.0001)，交互項AB、AC也對得率有顯著影響，且AC 對忽地笑多糖得率也有極顯著影響(P＜0.0001)，BC 影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Results of the variance analysis of regression model

2.2.2 響應面及最優化分析

3D 響應面和2D 等高線是回歸方程的圖形化表示，它提供了實驗值與預測值的關系和各個變量之間的相互作用，圓形和橢圓形等高線表示各變量之間的顯著水平，圓形等高線表示相應變量的交互作用不顯著，橢圓等高線表示相應變量的交互作用顯著。本實驗的曲面圖和等高線圖見圖2。

圖2(a)說明在提取時間一定時，提取溫度和液料比對忽地笑多糖得率的作用，隨著液料比的增大，忽地笑多糖得率逐漸增大，而隨著提取溫度的升高多糖得率先上升后減少。圖2(b)表示液料比一定時，提取溫度和提取時間對忽地笑多糖得率的影響，提取時間一定時，多糖得率隨著提取溫度的增加呈現先增大后減小的趨勢，提取溫度一定時，多糖得率隨著時間的延長逐漸增大。由圖2(c)可知，在提取溫度一定時，在等高線圖中，等高線形狀接近圓形，說明B 和C 兩個因素交互作用不明顯，也就是對忽地笑多糖得率的影響不顯著。

圖2 各兩因素交互作用對忽地笑多糖得率影響的響應面圖及等高線Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of four extraction parameters on L.aurea polysaccharide yield

2.3 最佳工藝確定與驗證性實驗

根據所得到的模型，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行分析，得到在最佳提取溫度69.74 ℃、提取時間7.68 h、液料比23.30∶1(mL∶g)時，多糖的理論得率為42.37%。為了檢驗響應面法的可行性，對回歸得到的最佳提取條件進行驗證實驗，但是考慮到實驗操作的可行性與簡便性，將最優提取條件該為:提取溫度70 ℃、提取時間7.7 h、液料比23∶1(mL∶g)、在此條件下進行5 次平行實驗，忽地笑多糖的得率為42.00%，與預測值的相對誤差為0.87%。說明實驗值與預測值基本吻合。因此，響應面法優化所得的提取條件參數準確可靠，具有一定的實用價值。

2.4 不同石蒜屬植物的不同形態學部位多糖含量比較

石蒜屬植物根、莖、葉等部位均含有多糖，但其含量在植物種類和組織器官間有顯著差異。如圖3所示，營養器官相比較，鱗莖最高，其次是根，葉中多糖含量最低，可能由于鱗莖為庫，葉片為源，同時，采集樣品是在2015年4 月初，而春出葉型的中國石蒜葉未成熟，導致含量最低;另一方面，多糖在五種石蒜屬植物間差異明顯，石蒜供試器官多糖含量均高于其他各種，尤其石蒜鱗莖中多糖最高可達49.21%;其次是稻草石蒜，除鱗莖和葉含量較高外，根中最高可達36.47%，相比之下，中國石蒜各器官多糖含量最低，可能因為中國石蒜由1000 m 以上的高海拔地區引入低海拔地區造成品種退化所致。因此，石蒜多糖提取適宜采用的石蒜屬植物為石蒜和稻草石蒜，除鱗莖作為提取材料外，根、葉也可采用，這樣對于充分利用石蒜屬植物資源，物盡其用具有重要意義。

圖3 不同石蒜屬植物多糖含量比較Fig.3 Comparison of polysaccharides contents in different Lycoris plant

3 結論

本實驗采用傳統的熱水提取忽地笑多糖，并比較了石蒜屬植物不同部位多糖含量，對石蒜屬多糖的后續開發和利用有較大的現實意義。探索了提取溫度、提取時間、和液料比對多糖得率的影響，經單因素和響應面實驗，得出熱水提取忽地笑多糖的最佳工藝為提取溫度70 ℃、提取時間7.7 h、液料比23∶1(mL∶g)，在此條件下得到的實際多糖提取率與預測值的相對誤差僅為0.87%，表明Box-Behnken 設計法用于石蒜多糖提取工藝的優化篩選是可行的。

石蒜屬植物不同器官多糖含量分布有差異，以鱗莖中多糖含量明顯高于根與葉;就種間鱗莖多糖比較，石蒜鱗莖含量最高，可達49.21%。因此選用良種是首要環節，故選擇石蒜鱗莖進行多糖提取，具有高效節能的效果。此研究可為合理開發利用石蒜源提供一定參考。

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