響應面法優化纖維素酶協同提取沙棘籽粕原花青素的工藝研究

歐陽健，金家宏，王洪倫

1中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;2中國科學院大學，北京 100049;3 伽藍(集團)股份有限公司，上海 200233

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是胡頹子科沙棘屬植物，為灌木或喬木，青藏高原是沙棘的起源地，青海是沙棘的重要分布區。沙棘資源具有分布廣、品種多和耐旱強等特點，僅青海省內，天然沙棘林面積5.3 萬hm2，人工林面積7.3 萬hm2，未成林造林面積達7.4 萬hm2，具有很大的產業開發潛力［1］。沙棘籽粕為沙棘籽超臨界CO2萃取油脂后的工業廢料，經檢測其蛋白質含量為20%，糖分為11.35%，脂肪為10.9%，總植物堿2.92 mg/kg，總黃酮502 mg/kg，另外還富含氨基酸、維生素等生物活性成分［2］。

現代藥理學研究表明［3-5］，沙棘具有抗腫瘤、抗心血管疾病和免疫調節等生物活性，尤其是沙棘中所含的原花青素類化合物具有較強的抗氧化及免疫調節等生理功能［6-9］。原花青素［10］是一類具有特殊分子結構的生物黃酮，是由不同數量的兒茶素和表兒茶素結合形成的聚合物，其中2～5 倍體被稱為低聚原花青素，大于5 倍體的稱為高聚原花青素。體外藥理試驗表明，原花青素是一種高效的抗氧化劑，它的抗自由基氧化能力是維生素E 的50 倍，維生素C 的20 倍，并且它在體內的半衰期長達6.67±0.95 h［11，12］。原花青素類化合物主要存在于大多數植物的果實、種子等組織中，對植物有著重要的保護作用［13］。沙棘果實被工業利用后的渣粕中仍含有較高的原花青素，以沙棘籽粕為原料研究原花青素的提取工藝，對沙棘資源的開發具有一定意義。

目前，以沙棘籽粕為原料進行原花青素的提取工藝研究較少，金海英［14］等研究了沙棘籽原花青素提取的單因素實驗，張弛［15］等對沙棘果原花青素的分離純化進行了研究，梅金龍［16］等研究了沙棘籽粕原花青素提取純化工藝。此外，禹華娟［17］等研究了蓮房原花青素的酶輔助提取工藝。纖維素酶協同超聲對沙棘籽粕原花青素的提取相關工藝未見報道。因此，本研究擬研究纖維素酶協同超聲提取沙棘籽粕原花青素的工藝，采用香草醛-鹽酸法［18］測定原花青素的含量并計算原花青素提取得率。通過單因素及響應面法對原花青素的提取工藝進行篩選優化，為沙棘籽粕原花青素的生產利用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

沙棘籽粕，于2013年取自青海康普生物科技股份有限公司提取籽油后籽粕;兒茶素標準品，購自成都曼思特生物科技有限公司;纖維素酶，BBL 公司，酶活力15000 U/g。

UV-759 型紫外-可見光分光光度計、PHS-3C 型pH 計，上海精密科學儀器有限公司;優普超純水器，成都超純水有限公司;超微粉碎機，浙江省溫嶺市創力藥材器械廠。

甲醇、鹽酸、香草醛均為分析純，天津百世化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料制備

將沙棘籽粕粉碎過60 目篩，得到試驗材料，放置于冰箱冷凍備用。

1.2.2 原花青素含量的測定［18］

1.2.2.1 標準曲線的繪制

配制兒茶素標準溶液，濃度為1.2 mg/mL。分別量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，然后定容至10 mL。準確量取各濃度兒茶素標準溶液1.0 mL，加入1%香草醛甲醇溶液2.5 mL 和8%鹽酸甲醇溶液2.5 mL，搖勻，避光，在30±1 ℃下，恒溫水浴保持30 min 后取出，用分光光度法在500 nm 波長下，測定其吸光值，得回歸方程為y=0.38x +0.02，R=0.9994，線性范圍為0.12～0.62 mg/mL。

1.2.2.2 樣品測定

準確稱取1.000 g 左右沙棘籽粕粉末，加入一定體積的甲醇，按各方案進行提取后，4000 rpm 離心15 min，取上清1.0 mL，按上述測定方法進行保溫比色，并按標準曲線回歸方程對原花青素提取得率進行計算。

1.2.3 試驗設計方法

該研究通過料液比、提取時間、提取次數、酶的用量和提取液pH 等因素的試驗結果，篩選出對沙棘籽粕原花青素提取工藝影響較大的因素，進行Box-Behnken 中心組合試驗設計(見表1)。

表1 Box-Behnken 設計因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過程中，設置不同的料液比，在室溫下，甲醇溶液超聲輔助提取45 min，研究料液比對原花青素提取的影響，結果見圖1A。原花青素的提取得率隨著料液比的增加而呈現增加的趨勢，其中料液比為1∶30 g/mL 時，原花青素提取得率較高，而后變化趨勢不明顯。因此選取料液比1∶30 g/mL 進行其他單因素試驗。

2.1.2 提取時間對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過程中，設置不同的提取時間，在室溫下，料液比為1∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取，研究提取時間對原花青素提取的影響，結果見圖1B。原花青素的提取得率隨提取時間的增加有一定的增加，45 min 前變化趨勢較為明顯，而后變化趨于平緩。因此，選擇甲醇超聲輔助提取時間45 min、料液比1∶30 g/mL 進行其他單因素試驗。

2.1.3 提取次數對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

沙棘籽粕原花青素的提取過程中，考慮不同的提取次數，在室溫下，料液比為1∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取45 min，研究提取次數對沙棘籽粕原花青素提取的影響，結果見圖1C。原花青素的提取得率對提取次數的增加有一定的變化，但變化趨勢較為不明顯，尤其是提取3 次以上幾乎無差異，因此，甲醇超聲輔助提取3 次、每次45min、料液比1∶30 g/mL 進行其他單因素試驗。

2.1.4 酶的用量對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

試驗選用纖維素酶協同甲醇超聲提取沙棘籽粕中的原花青素，考慮不同纖維素酶的用量，在室溫下，料液比為1 ∶30 g/mL，甲醇超聲輔助提取45 min，研究酶的用量對沙棘籽粕原花青素提取的影響，結果見圖1D。沙棘籽粕中，原花青素需突破細胞壁的束縛才能進入提取溶劑中，細胞壁的主要成分之一即為纖維素，它在纖維素酶的催化作用下，可快速降解，使細胞壁出現裂解的現象，使原花青素更易進入提取溶劑中，提高其提取得率［19］。試驗結果表明，在纖維素酶的作用下，原花青素的提取得率有明顯的提高，但當酶的用量達到3%(每1 g 原料添加0.03 g 纖維素酶，下同)后，原花青素的提取得率無明顯變化。因此，選擇甲醇超聲輔助提取3 次、每次45 min、料液比1∶30 g/mL 和酶的用量為3%進行其他單因素試驗。

2.1.5 提取液pH 對沙棘籽粕原花青素提取得率的影響

試驗選用纖維素酶協助甲醇超聲提取沙棘籽粕中的原花青素，而酶活力容易受到pH 影響。因此，在提取過程中，考慮提取液pH，在室溫下，甲醇超聲輔助提取3 次、每次45 min、料液比1∶30 g/mL 和酶的用量為3%，研究提取液pH 對沙棘籽粕原花青素提取的影響，結果見圖1E。試驗表明，當pH 小于3或大于7 時，原花青素的提取得率均處于較低水平，而當pH 為5 時，原花青素的提取得率最高，且表明pH 對原花青素提取得率影響較大，其原因可能與提取液pH 對纖維素酶的影響有關，纖維素酶的最佳pH 在4.0～5.5 之間［20］。當提取液pH 過酸和過堿，均使纖維素酶不能具有較高的催化效率，而影響原花青素的提取得率。

2.2 響應面法試驗設計及結果

2.2.1 分析單因素結果顯示

甲醇超聲輔助提取3 次、酶的用量為3%時沙棘籽粕原花青素有最大的提取率。沙棘籽粕原花青素提取的響應面試驗設計及試驗結果見表2，結合Box-Behnken 中心組合實驗設計原理，按照表1 對提取時間、料液比和提取液pH 作變換，以原花青素提取得率為響應值(Y)，共17 個試驗點，其中1～12 組為析因試驗，13～17 組為中心試驗，用來分析試驗誤差。

表2 原花青素提取得率試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface analysis for the optimization of extraction conditions of PC

采用Design Expert 8.05b 軟件對沙棘原花青素提取得率數據進行回歸擬合分析，得回歸方程:原花青素提取得率Y=3.08+0.080X1+0.068X2+0.16X3+2.5 ×10-3X1X2-0.027X1X3-2.5 ×10-3X2X3-。

表3 方差分析結果Table 3 ANOVA of regression analysis

2.2.2 模型的顯著性檢驗

從回歸模型方差分析(表3)可見，試驗選用的模型極顯著(P＜0.0001)，失擬項不顯著P=0.1066＞0.05，說明模型是適合的;模型的校正決定系數=0.9961，說明該模型能解釋99.61%響應值的變化，僅有總變異大約0.39%不能用該模型進行解釋;相關系數R2=0.9983，說明該模型擬合程度較好，預測值與實測值之間有較好的相關性，試驗誤差小，可以用該模型來分析和預測沙棘籽粕原花青素的提取得率。

由表3 方差分析結果可知，在此試驗設計中，一次項X1、X2、X3均極顯著(P＜0.01)，二次項X1X2、X2X3、X1X3均不顯著(P＞0.05)，均極顯著(P＜0.01)。

2.2.3 響應面交互作用分析

回歸模型的響應面及其等高線見圖2，3 組圖直觀地反映了各因素對響應值的影響。由三組圖對比可知，提取液pH(X3)對沙棘籽粕原花青素提取得率影響最為顯著，表現為圖2B1、2C1 的曲面較陡。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，橢圓表示兩因素交互作用顯著，圓形則相反。由圖2B2、2C2等高線可得知，提取時間與pH 值和料液比與pH 值的交互作用較為明顯，表現為等高線略成橢圓形。相比而言，提取時間與料液比之間的交互作用稍弱。

圖2 提取時間(X1)與料液比(X2)、提取時間(X1)與提取液pH(X3)及提取時間(X1)與提取液pH(X3)交互作用響應面圖(A1、B1、C1)與等高線圖(A2、B2、C2)Fig.2 Responsive surface plots (A1、B1、C1)and contour plots (A2、B2、C2)showing the mutual effects of extraction duration(X1)and ratio of solid to liquid (X2)，extraction duration (X1)and pH value of extraction solvent (X3)，ratio of solid to liquid (X2)and pH value of extraction solvent (X3)on the yield of PC

2.2.4 最優提取工藝參數

通過Design-Expert8.05b 軟件求解回歸方程得出的最佳提取工藝參數為:纖維素酶協同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時間54.02 min，料液比32.01 g/mL，pH 值為5.31 提取3 次，測定并計算原花青素提取得率。綜合考慮試驗的操作性、效率和成本等，將沙棘籽粕原花青素提取工藝參數修正為:纖維素酶協同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時間55 min，料液比1∶30 g/mL，pH 值為5.0，提取3 次，此條件下，沙棘籽粕原花青素提取得率的理論值達到3.09%。

2.2.5 試驗模型的驗證和比較

按照模型得到的最優提取參數與實踐過程中的簡便性得到的最終條件驗證試驗模型。試驗結果表明，模型提取參數按實際操作簡化后實際提取得率為(3.07±0.0080)%，與理論最大值非常接近，說明該模型可以較好的反映沙棘籽粕原花青素的提取參數，也說明用響應面法對原花青素提取得率進行參數優化是可行的。

3 結論

利用纖維素酶協同甲醇超聲輔助提取沙棘籽粕原花青素，通過單因素試驗篩選出料液比、提取時間和提取液pH 值對原花青素提取得率的影響較為明顯，進一步根據Box-Benhnken 原理進行響應面試驗設計，優化沙棘籽粕原花青素提取的最佳工藝參數，并進行穩定性的檢驗。根據響應面分析模型方程Y=3.08+0.080X1+0.068X2+0.16X3+2.510-3，得出沙棘籽粕原花青素的最佳提取工藝參數:纖維素酶協同甲醇超聲提取，超聲功率250 W，室溫下，酶的用量為3%，提取時間55 min，料液比1∶30 g/mL，pH 值為5.0，提取3 次。在此條件下，沙棘籽粕原花青素提取得率為3.07%。該研究通過單因素及響應面法對原花青素的提取工藝參數進行優化篩選，為沙棘籽粕中原花青素的生產利用提供一定的理論基礎。

1 Chen XW(陳修文)，Zhao HL(趙宏利).Development and utilization of sea buckthorn resources in qinghai province.Nat Res(自然資源)，1992，6:47-51.

2 Wu AH(武挨厚)，Mi L(米拉)，Dong QJ(董交其)，et al.Nutritive value of Hippophae rhomnoides fruit residue and its application.J Inner Mongolia Instit Agric Animal Husb (內蒙古農牧學院學報)，1993，1:50-54.

3 Gao X，Ohlander M，Jeppsson N，et al.Changes in antioxidant effects and their relationship to phytonutrients in fruits of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.)during maturation.J Agric Food Chem，2000，48:1485-1490.

4 Suryakumar G，Gupta A.Medicinal and therapeutic potential of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.).J Ethnopharmacol，2011，138:268-278.

5 Panossian A，Wagner H.From traditional to evidence-based use of Hippopha? rhamnoides L.:chemical composition，experimental，and clinical pharmacology of sea buckthorn berries and leaves extracts.Evid Rational Based Res Chin Drugs，2013:181-236.

6 Al-malki AL，Sayed AAR，El Rabey HA.Proanthocyanidin attenuation of oxidative stress and NF-κB protects apolipoprotein E-deficient mice against diabetic nephropathy.Evid-Based Comple Alter Med，2013，2013:1-8.

7 Gentile C，Allegra M，Angileri F，et al.Polymeric proanthocyanidins from Sicilian pistachio (Pistacia vera L.)nut extract inhibit lipopolysaccharide-induced inflammatory response in RAW 264.7 cells.Eu J Nutri，2012，51:353-363.

8 A-sowayan NS，Kishore U.Prophylactic efficacy of a combination of proanthocyanidin and vitamin E on hepatotoxicity induced by doxorubicin in rats.Int J Pharm，2012，2:161-169.

9 Shin MO，Yoon S，Moon JO.The proanthocyanidins inhibit dimethylnitrosamine-induced liver damage in rats.Arch Pharmacol Res，2010，33:167-173.

10 Hummer W，Schreier P.Analysis of proanthocyanidins.Mole Nutri Food Res，2008，52:1381-1398.

11 Bagchi D，Garg A，Krohn R，et al.Oxygen free radical scavenging abilities of vitamins C and E，and a grape seed proanthocyanidin extract in vitro.Res Commun Mole Pathol Pharmacol，1997，95:179-189.

12 Stoupi S，Williamson G，Viton F，et al.In vivo bioavailability，absorption，excretion，and pharmacokinetics of［14C］procyanidin B2 in male rats.Drug Metabol Dispos，2010，38:287-291.

13 Deprez S，Brezillon C，Rabot S，et al.Polymeric proanthocyanidins are catabolized by human colonic microflora into lowmolecular-weight phenolic acids.J Nutri，2000，130:2733-2738.

14 Jin HY(金海英).Single-factor tests extraction of proanthocyanidins from Hippophae rhamnoides seed.Hippophae(沙棘)，2006，18(4):29-32.

15 Zhang C(張馳)，Xu XY (徐曉云)，Pan SY (潘思軼).Study on isolation and purification of procyanidins from seabuckthorn Fruit.Food Sci (食品科學)，2005，26:183-185.

16 Mei JL (梅金龍)，Hu CY(胡長鷹)，et al.Extraction and purification of procyanidine from sea buckthorn seed meal.China Oils Fats(中國油脂)，2010，7(35):50-53.

17 Yu HJ (禹華娟)，Sun ZD (孫智達)，Xie BJ (謝筆鈞).Enzyme assistant extraction of procyanidins from seedpod of lotus and the comparison of antioxidant activity.Nat Prod ResDev (天然產物研究與開發)，2010，22:154-158.

18 Li CY (李春陽)，Xu SY (許時嬰)，Wang Z (王璋).Vanillin-HCl assay for the proanthocyanidins content of grape seed and stem.Food Sci (食品科學)，2004，35:157-161.

19 Pettersson G.Structure and function of a cellulase fromPenicillium notatum as studied by chemical modification and solvent accessibility.Arch Biochem Biophysics，1968，126:776-784.

20 Ingram L，Gomez P，et al.Metabolic engineering of bacteria for ethanol production.Biotechnol Bioeng，1998，58:204-214.