響應面法優化馬蘭總三萜提取工藝研究

王國凱，王 諍，蔡百祥，高衛娜，劉勁松，王 剛

安徽中醫藥大學藥學院 現代中藥安徽省重點實驗室，合肥 230012

馬蘭［Kalimeris indica (L.)Sch.-Bip］為菊科馬蘭屬植物［1］，具有涼血、清熱、利濕、解毒等功效［2］。臨床使用馬蘭治療乙肝的臨床多有報道，且療效顯著［3，4］。三萜類化合物是廣泛存在于中藥中的一類化合物，多數三萜由30 個碳原子組成。研究表明三萜類化合物具廣泛的生物活性，具有較強的抗炎、抗菌、抗腫瘤等生物活性［5］，在前期研究的基礎上［6］，本實驗旨在運用響應面法優選馬蘭最佳提取工藝，繼而最大限度提取馬蘭總三萜，保證能充分利用馬蘭藥材資源，提高經濟效益，為研究開發馬蘭提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

馬蘭全草2013年購自安徽亳州藥材市場，標本經中藥標本中心楊青山老師鑒定為菊科馬蘭屬植物馬蘭;齊墩果酸(批號:110709 -201311)購自阿拉丁試劑有限公司;其它試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

UV757CRT 紫外可見分光光度計(島津);AG-285 型十萬分之一電子天平(賽多利斯);DZF-6050型真空干燥箱(上海博迅)。

2 實驗方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對照品10.07 mg，用90%乙醇定容至50 mL，制成0.2014 mg/mL 的溶液作為對照品溶液。

2.2 標準曲線的繪制

分別吸取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于試管中，水浴蒸干，分別加入新配制的5 %香草醛-冰醋酸0.2 mL 和高氯酸1.2 mL，搖勻后，置于70 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，加乙酸乙酯3.6 mL，隨行試劑做空白，波長550 nm 處測定吸光度，繪制標準曲線。回歸方程y=48.619x-0.0742(r=0.9983)。

2.3 供試品溶液的制備及含量測定

精確稱取馬蘭提取物0.1 g，用90%乙醇定容至50 mL 容量瓶中超聲至完全溶解。取2 mL 溶液，用90%乙醇定容至10 mL 容量瓶，搖勻。取供試品溶液1 mL 于試管中，85 ℃水浴蒸干，加入新配制的5%香草醛冰醋酸(5g 香草醛用冰醋酸溶解后，定容至100 mL)0.2 mL，高氯酸1.2 mL，放至70 ℃水浴中加熱15 min。取出流水冷卻至室溫，加乙酸乙酯3.6 mL，隨行試驗做空白［7，8］。用紫外分光光度計波長550 nm 處測定，代入回歸方程供試品中馬蘭總三萜的含量。

2.4 單因素試驗

2.4.1 乙醇濃度考察

稱取藥材50 g 各五份，以提取時間為1.5 h，提取次數為3 次，料液比為1∶15 g/mL，乙醇濃度分別以40%、50%、60%、70%、80%回流提取。

2.4.2 料液比考察

稱取藥材50 g 各五份，以提取時間為1.5 h，提取次數為3 次，料液比分別以1 ∶9、1 ∶12、1 ∶15、1∶18、1∶21 g/mL 50%乙醇回流提取。

2.4.3 提取時間考察

稱取藥材50 g 各五份，料液比為1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取次數為3 次，提取時間分別以0.5、1、1.5、2、2.5 h 進行回流提取。

2.4.4 提取次數考察

稱取藥材50 g 各五份，料液比為1 ∶15 g/mL 90%乙醇，提取時間為1.5 h，提取次數分別以1、2、3、4、5 次進行回流提取。

2.5 響應面法優化馬蘭總三萜的提取工藝

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理［9，10］，選出影響馬蘭總三萜取率的四個主要因素:乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(D)，進行這四個因素三水平的響應面分析試驗，考察目標為總三萜提取率。采用Design-Expert 8.0.5b 軟件對數據進行分析處理。

表1 響應面分析因素及水平Table 1 Factors and levers of RSM analysis

圖1 乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)及提取次數(D)對馬蘭總三萜的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid/liquid ratio (B)，ultrasonic duration (C)and times of extraction (D)on the yield of total triterpenes

3 實驗結果

3.1 單因素試驗結果

單因素試驗考察結果可知50%乙醇、1∶15 g/mL、提取1.5 h、提取3 次提取最佳。

3.2 響應面結果

以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取次數(D)為自變量，以得率(Y)為響應值，用Design-Expert 8.0.5b 軟件進行四因素三水平的響應面分析實驗結果。

表2 響應面分析實驗結果Table 2 The result of response surface design

對以上中心組合數據進行處理，可得到二次響應面的回歸方程為:Y=+0.024-1.541E-003 ×A +3.869E-004 ×B+2.938E-004 ×C+2.493E-003 ×D-3.825E-004 ×AB +1.087E-003 ×AC-1.366E-003 ×AD-1.892E-004 ×BC-1.821E-004 × BD-1.395E-003×CD-2.454E-004 ×A2-2.501E-004 ×B2 +2.577E-004 ×C2-2.527E-003 ×D2

由回歸方程可知，對馬蘭總三萜提取率的影響大小順序為:提取次數＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間。對該方程進行回歸分析。

表3 回歸分析結果Table 3 Analysis of variance for the developed polynomial model

結果表明A、B、C、D、AB、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2因素對馬蘭總三萜的提取率影響顯著，表明四個因素均有顯著的影響;其中AB、AC、CD 顯著表明在提取過程中乙醇濃度和料液比，乙醇濃度和提取時間，提取時間和提取次數的交互作用也會對馬蘭總三萜提取率帶來顯著影響。進一步分析方程方差可知，由總模型P＜0.001 可知本實驗所選取的二次多項式模型具有高度的顯著性;失擬項為0.8812＞0.05，故失擬項不顯著;決定系數R2=0.9959，校正決定系數R2Adj=0.9919，結果說明模型可以解釋響應值的變化，說明擬合度較好，可以采用此模型對馬蘭總三萜的提取工藝進行優化。

3.3 響應面圖與等高線圖分析

圖2A～D 是根據多元回歸方程得到的四個因素對馬蘭總三萜提取率影響的響應面圖及等高線圖。圖2A 顯示了乙醇濃度與料液比對馬蘭總三萜得率的交互作用，由圖可知，等高線呈橢圓形，說明乙醇濃度和料液比之間的交互作用顯著。圖2B 顯示了乙醇濃度與提取時間對馬蘭總三萜得率的交互作用，由圖可知，等高線呈橢圓形，說明乙醇濃度與提時間之間的交互作用顯著。圖2C 顯示了乙醇濃度與提次數對馬蘭總三萜得率的交互作用，由圖可知，等高線呈橢圓形，說明乙醇濃度與提次數之間的交互作用顯著。圖2D 顯示了提取時間與提次數對馬蘭總三萜得率的交互作用，由圖可知，等高線呈橢圓形，說明提取時間與提次數之間的交互作用顯著。

3.4 驗證性試驗

圖2 各交互作用對馬蘭總三萜影響的響應曲面Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of different factors on the yield of total triterpenes

通過數據分析，可得到馬蘭總三萜提取的最佳工藝為:乙醇濃度40%;料液比1∶18 g/mL;提取時間1 h;提取次數3.98 次。在此條件下，馬蘭總三萜提取率的理論值為2.83758%。綜上考慮:提取次數為4 次。驗證性試驗在此條件下平行提取3 次，測得實際提取率均值為2.68%。

4 結論

本次實驗通過運用響應面法設計優化馬蘭總三萜的最佳提取工藝為乙醇濃度40%，料液比1∶18 g/mL，提取次數4 次，提取時間1 h。經最佳工藝得到的馬蘭總三萜的含量為26.83 mg/g。

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