7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾的胃毒活性及作用機(jī)理初探

齊強(qiáng)強(qiáng)，楊敏麗，郭宏霞

上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234

7-脫甲氧基娃兒藤堿(7-Demethoxytylophorine)是從蘿藦科植物牛心樸子(Cynanchum komarovii)中分離出來的一種重要生物堿［1］。研究表明，這種生物堿對(duì)活體植株煙草花葉病毒TMV 和活體植株馬鈴薯Y 病毒有很高的抑制活性;對(duì)小麥赤霉病菌Gibberella zeae、番茄早疫病菌Altemaria solani、花生褐斑病菌Cercospora arachidicola 等植物病菌也有很好的殺菌活性［2］;還能抑制蝴蝶乳草花Asclepias tuberose、敘利亞馬利筋A(yù)sclepis syriaca 和大麻Cannabis sativa 等根系的生長［3］。此外，7-脫甲氧基娃兒藤堿還具有很好的抗癌活性，對(duì)白血病細(xì)胞P-338、人肝癌細(xì)胞Hep G2、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 和HT-29 和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 等均表現(xiàn)很好的細(xì)胞毒活性［4，5］。

本課題組在研究牛心樸子的殺蟲活性時(shí)發(fā)現(xiàn)其生物堿對(duì)小菜蛾(Plutella xylostella L.)有很好的毒殺作用［6］，采用活性跟蹤的方法從其總生物堿中分離得到7-脫甲氧基娃兒藤堿，初步活性測試表明該堿對(duì)小菜蛾有較好的活性［7］。本文以小菜蛾為試蟲，采用葉碟添加法測試了7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾的胃毒活性，并結(jié)合電子顯微鏡技術(shù)和生化測試技術(shù)研究了它對(duì)小菜蛾中腸組織和消化酶活性的影響，研究結(jié)果表明7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾幼蟲有較好的胃毒活性，其活性與對(duì)中腸上皮組織的破壞和消化酶的抑制有關(guān)。研究結(jié)果為更好地開發(fā)和利用7-脫甲氧基娃兒藤堿在殺蟲方面的作用及新農(nóng)藥研究開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥液和試劑

7-脫甲氧基娃兒藤堿由本課題組從鵝絨藤屬植物牛心樸子中分離得到［7］，高效液相色譜法(Agilent 1100)測試其純度為95.5%。準(zhǔn)確稱取一定量7-脫甲氧基娃兒藤堿，用50%丙酮溶解并定容，配制成一定濃度的溶液，測試時(shí)根據(jù)需要稀釋成相應(yīng)的濃度，作為供試藥液。

Carnoy 固定液(自制):60 mL 無水乙醇+30 mL氯仿+10 mL 冰醋酸。試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.1.2 供試?yán)ハx

小菜蛾:由本實(shí)驗(yàn)室人工繼代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境:溫度23～26 ℃，濕度60%～70%，光照L∶D=14 h∶10 h。試驗(yàn)時(shí)挑選健康、蟲體大小均一的3 齡幼蟲。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HP400GS 人工氣候箱(武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)，L/L-S 電子天平(0.0001g，梅特勒-托利多儀器公司)，Leica RM2255 型石蠟切片機(jī)(德國Leica 公司)，Leica 雙目顯微鏡(德國Leica 公司)，LY-MN-HPDCCD 萬能視頻成像裝置(成都勵(lì)揚(yáng)精密機(jī)電有限公司)，Neofuge 23R 臺(tái)式冷凍離心機(jī)(力康發(fā)展有限公司)，UV2450 紫外-可見分光光度儀(日本島津公司)，HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

1.3 胃毒活性測試方法

將供試藥液用50% 丙酮依次稀釋成8.00、4.00、2.00、1.00、0.500 mg/mL，采用葉蝶添加法［8］測試其胃毒活性:用圓形打孔器(φ=1.5 cm)將新鮮甘藍(lán)葉打成葉碟，放入供試藥液中浸漬5 s(對(duì)照葉碟以50%丙酮作相同處理)，取出晾干放入培養(yǎng)皿中(內(nèi)墊濾紙，用棉花球吸蒸餾水保濕)。每皿十字交叉放入4 片處理葉碟，接入10 頭饑餓6 h 的3齡小菜蛾幼蟲，每組重復(fù)3 次。48 h 后換成新鮮葉蝶，72 h 后開始記錄試蟲死亡情況和化蛹情況，連續(xù)觀察7 d。

死亡標(biāo)準(zhǔn):蟲體變黑，成不規(guī)則的“1”或“V”字型，毛筆觸之不動(dòng)。

按照公式(1)、(2)、(3)計(jì)算死亡率、校正死亡率和化蛹率，藥劑濃度轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)，校正死亡率轉(zhuǎn)化為死亡幾率，以死亡幾率對(duì)藥劑濃度對(duì)數(shù)做回歸分析，得毒力回歸方程，計(jì)算致死中濃度(LC50)。

1.4 組織病理學(xué)觀察

用2.0 mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿藥液處理試蟲，72 h 后分別選中毒試蟲、死亡試蟲和50%丙酮處理的對(duì)照試蟲各30 頭投入60 ℃水中，蟲體伸直后剪除頭部，投入Carnoy 固定液。按常規(guī)石蠟切片法制成病理組織切片，HE 染色［9］。

1.5 小菜蛾體內(nèi)消化酶活性的測試

1.5.1 酶液提取

分別挑選用2.0 mg/mL 藥液處理24、48 h 的試蟲及50%丙酮對(duì)照處理試蟲各25 頭，按照蟲體質(zhì)量與甘油體積1∶10(g∶mL)的比例加入預(yù)冷的20%甘油，勻漿后于4 ℃，10000 r/min 離心20 min，取上清液做酶源［10］。20%甘油定容成25 mL，0 ℃冰箱中保存，12 h 內(nèi)測定。

1.5.2 消化酶活力的測定

淀粉酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸法［11］，用麥芽糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，緩沖溶液用pH 7.5 磷酸緩沖溶液，以30 ℃、20 min 內(nèi)每分鐘單位質(zhì)量的淀粉酶水解淀粉生成麥芽糖的量作為淀粉酶活力單位:mg/mg pro/min。

蛋白酶活力測定采用福林-酚法［12］，F(xiàn)olin-甲液為0.20 mol/L Na2CO3，pH 8.0 的磷酸緩沖溶液，用酪氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。以30 ℃、15 min 內(nèi)每分鐘單位質(zhì)量的蛋白酶水解酪蛋白生成酪氨酸的量作為蛋白酶活力單位:mg/mg pro/min。

脂肪酶活力測定采用橄欖油乳劑比濁法［13］，用橄欖油乳劑制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，緩沖溶液用pH 8.8 的Tris-HCl 溶液。以30 ℃、20 min 內(nèi)每分鐘單位質(zhì)量脂肪酶水解橄欖油生成甘油三酯的物質(zhì)的量為脂肪酶活力:m mol/mg pro/min。

按公式(4)、(5)分別計(jì)算酶活性和酶活性抑制率

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2003 和DPS(7.05)專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行系統(tǒng)分組分析，用Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾的胃毒活性

使用葉碟添加法測試了7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾的胃毒活性，結(jié)果見表1。分析結(jié)果可知，7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾有較好的胃毒活性，隨著藥液濃度的增大和處理時(shí)間的延長，試蟲死亡率不斷增大，化蛹率不斷減小，8.00 mg/mL 藥液處理7 d 的死亡率為76.67%，化蛹率僅為10.00%，LC50為2.60 mg/mL。處理后存活的幼蟲在測試時(shí)間內(nèi)不能正常生長，或者一直處在幼蟲期，處理24 h后的小菜蛾幼蟲出現(xiàn)取食減緩，爬動(dòng)減緩，部分試蟲出現(xiàn)中毒癥狀:停止取食、身體發(fā)軟;隨時(shí)間延長，蟲體應(yīng)激性降低，并出現(xiàn)水腫、繼而破裂，身體失水皺縮等死亡癥狀。

表1 7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾的胃毒活性Table 1 Stomach toxicity of 7-demethoxytylophorine against 3th instar larvae of P.xylostella

2.2 7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾中腸組織的影響

用雙目顯微鏡觀察小菜蛾組織病理切片。圖1中A、B、C 部分分別為中毒試蟲、對(duì)照試蟲及死亡試蟲的組織切片圖。從圖1(B)可以看出，對(duì)照處理的小菜蛾的腸壁上皮細(xì)胞排列整齊，杯狀細(xì)胞和柱狀細(xì)胞錯(cuò)落有致，微桿和杯腔基部微絨毛清晰，圍食膜完整，腸腔內(nèi)食物積累甚少。從圖1(A)可知，中毒試蟲食物積累較多，中腸壁彎曲、腸壁細(xì)胞排列疏松，微桿呈消融狀態(tài)，杯腔內(nèi)充塞，杯腔基部微絨毛消失，圍食膜破壞，但上皮細(xì)胞未見明顯破壞;從圖1(C)可知，死亡試蟲腸壁細(xì)胞排列凌亂，圍食膜完全破壞。上皮細(xì)胞明顯破壞。分析圖1 可知，7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾的中腸組織上皮細(xì)胞有明顯作用。中毒初期先作用于圍食膜，深度中毒試蟲的圍食膜被破壞失去保護(hù)上皮細(xì)胞的功能，造成中腸上皮細(xì)胞被破壞而致死。

2.3 7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾消化酶活力的影響

按照以上方法分別測試了中毒試蟲和對(duì)照試蟲體內(nèi)淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性，結(jié)果如表2。

2.00mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿處理組及對(duì)照組淀粉酶活力差異顯著(F3，8=175.96，P＜0.0001)。處理24 h 淀粉酶活力與對(duì)照無差異;處理48 h 淀粉酶活力明顯下降，抑制率達(dá)到71.8%，與處理后24 h 相比，處理48 h 酶活力下降了26.0%。

2.00mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿處理組及對(duì)照組蛋白酶活力差異顯著(F3，8=2379.92，P＜0.0001)。處理后24 h 對(duì)蛋白酶活力抑制率為87.1%;處理48 h 抑制率為93.4%。與處理后24 h相比，處理48 h 蛋白酶活力下降了66.8%。

圖1 7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾中腸的影響Fig.1 Effects of 7-demethoxytylophorine on midgut tissues of 3th instar larvae of P.xylostella

2.00mg/mL 7-脫甲氧基娃兒藤堿處理組及對(duì)照組脂肪酶活力差異顯著(F3，8=2042.23，P＜0.0001)。處理24 h 后對(duì)脂肪酶活力的抑制率為67.0%;處理48 h 后抑制率為89.2%，與處理后24 h 相比，處理48 h 脂肪酶活力下降了53.2%。

表2 7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾消化酶活力的影響Table 2 Effect of 7-demethoxytylophorine on the activity of digestive enzymes of 3th instar larvae of P.xylostella

3 結(jié)論

7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾有較好的胃毒活性，但活性作用較慢，活性隨藥液濃度的增加和處理時(shí)間延長而增強(qiáng)。藥液濃度為8.00 mg/mL 時(shí)，處理7 d 的死亡率為76.67%，相應(yīng)的LC50為2.60 mg/mL。中毒后的小菜蛾應(yīng)激性很低，生長速度明顯減緩，化蛹率也明顯降低，僅為10% (對(duì)照為93%)。死亡試蟲蟲體水腫、變黑，體型呈不規(guī)則的“V”字或者“1”字型。

7-脫甲氧基娃兒藤堿對(duì)小菜蛾的胃毒活性可能與其對(duì)小菜蛾消化系統(tǒng)的破壞和酶的抑制有關(guān)。7-脫甲氧基娃兒藤堿處理后的小菜蛾幼蟲中腸杯狀細(xì)胞受損，圍食膜不同程度被破壞，試蟲死亡可能與中腸上皮細(xì)胞破壞有關(guān)。同時(shí)，中毒試蟲的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶的活性均受到不同程度的抑制，但低濃度的藥液對(duì)處理初期小菜蛾的取食活動(dòng)影響較小，這與實(shí)驗(yàn)切片中觀察到的腸內(nèi)食物滯留使得中腸與對(duì)照相比變粗的情況一致，處理24 h 后小菜蛾取食減緩應(yīng)與消化酶活性降低有關(guān)。藥劑對(duì)昆蟲消化系統(tǒng)的破壞，必將導(dǎo)致昆蟲營養(yǎng)不良，生長發(fā)育受阻乃至死亡。

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