叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基活性研究

馬國財，趙麗娜，白紅進

1塔里木大學生命科學學院 新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室;2 塔里木大學分析測試中心，阿拉爾 843300

叉枝鴉蔥(Scorzonera divaricata)俗稱堿草，系菊科鴉蔥屬植物，多生于草原、半荒漠和荒漠地帶，能夠固定沙丘、戈壁和干河床上。全草入藥，能清熱解毒，主治療毒惡瘡［1］。目前，鴉蔥屬植物關于化學成分的研究文獻較多，主要有揮發油、無機物質、氨基酸、萜類、甾體類、鞣質、黃酮類化合物等［2-9］，文獻對叉枝鴉蔥的研究報道較少。陶大勇［2］等采用分光光度法測定了塔里木盆地叉枝鴉蔥中鞣質的含量，陳瑛［3］等對叉枝鴉蔥有機溶劑提取物中生物堿進行了測定，二者都沒有對其所含的鞣質和生物堿單體化合物進行進一步的分離與檢測。

Harman［10］提出的自由基學說認為:自由基攻擊生命大分子造成的損傷是引起衰老的根本原因，也是誘發腫瘤等疾病的重要原因，這一學說已經廣泛的被人們所日益接受。近二十年來，對自由基及其清除率的研究已經成為天然產物研究的熱點，各國研究人員越來越多的將注意力集中于篩選有阻斷自由基形成或抑制細胞過氧化活性的天然藥物研究，其中對黃酮類化合物的研究是自由基清除劑研究的熱門領域之一［11］。

本文利用紫外-可見分光光度法對叉枝鴉蔥全草中總黃酮清除DPPH 自由基活性進行研究，為叉枝鴉蔥的合理開發利用和提高其生物利用度提供了科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CARY-100 紫外可見光分光光度計(澳大利亞VARIAN 公司);KQ-400KDE 臺式通用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JA1203 電子天平(上海恒平科學儀器有限公司)。

1.2 試劑

蘆丁對照品(德國Dr.Ehrdnstorfer 公司 批號:60922);DPPH 自由基(和光純藥工業株式會社，批號:ALL1930);乙醇，硝酸鋁，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，三氯化鋁等，均為國產分析純。

1.3 材料

叉枝芽蔥于2009年5 月，采集于新疆建設兵團第四十五團。自然陰干，粉碎，過60 目篩，待用。經塔里木大學植物科學學院劉艷萍副教授鑒定為菊科(Compositae)鴉蔥屬(Scorzonera)叉枝鴉蔥(Scorzonera divaricata)植物。

2 實驗方法

2.1 叉枝鴉蔥總黃酮提取

精密稱取叉枝鴉蔥粉末1.000 g，加65%乙醇20 mL，微波提取20 min，功率40 W，濾過，殘渣再加入65%乙醇20 mL，重復提取2 次，過濾，合并濾液，定容于100 mL 容量瓶中，備用。

2.2 蘆丁對照品溶液的制備

精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品13.60 mg 置50 mL 容量瓶中，加65%乙醇20 mL，超聲使溶解，再加65%乙醇定容至刻度，搖勻即得。蘆丁對照品濃度為0.272 mg/mL，備用。

2.3 顯色條件的考察［12］

2.3.1 顯色系統的篩選

方法1:分別精密吸取0.5 mL 的蘆丁標準品溶液和2 mL 樣品溶液于10 mL 容量瓶中，加0.1 mol/L 的AlCl3溶液2 mL，搖勻，放置6 min;再加入1 mol/L 的4% NaoH 溶液3 mL，用65%乙醇溶液定容，搖勻，放置10 min，測定。

方法2:分別精密吸取0.5 mol 的蘆丁標準溶液和2 mL 的樣品溶液于10 mL 容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.4 mL 搖勻，放置6 min;加10% Al(NO3)30.4 mL，搖勻，放置6min;再加4% NaOH 溶液4 mL，65%乙醇定容，搖勻，放置10 min，測定。

結果表明:方法2 顯色靈敏、穩定，故采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 為顯色系統

2.3.2 最大吸收波長的確定

精密稱取蘆丁對照品溶液0.5 mL 和2.1 項下樣品溶液2 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，加65%乙醇至3 mL，按2.3.1 項下方法2 進行顯色，測定。以65%乙醇平行實驗為空白參比，于400～800 nm波長范圍內掃描。

2.4 標準曲線的繪制［13］

精密吸取蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于容量瓶中，按2.3.1 項下方法2 操作，以第一份溶液為空白，在501 nm 處測定吸光度。吸光度(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程A=0.0124X-0.0322(r=0.9996)，表明蘆丁在27.2～163.2 μg/mL 范圍內與吸光度值線性關系良好。

2.5 叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 的反應動力學研究

將2 mL 不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮提取液與2 mL、40 μg/mL 的DPPH 自由基反應，以相同濃度的蘆丁和VC 為對照，測定不同反應時間的吸光度，研究不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮與DPPH 自由基反應隨時間推移的動力學關系，以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制不同濃度的叉枝鴉蔥總黃酮與DPPH 自由基隨時間推移的動力學關系曲線圖。

2.6 叉枝鴉蔥總黃酮對DPPH 自由基的清除率［14，15］

在叉枝鴉蔥總黃酮清除自由基的反應動力學研究的基礎上，測定反應平衡時的吸光度，按下式計算不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮對DPPH 自由基的清除率:K=［1-(Ai-Aj)/Ac］×100%。式中，K 為叉枝鴉蔥總黃酮對DPPH 自由基的清除率，Ai 為加式樣反應后DPPH 溶液的吸光度Aj 為不加DPPH，只加式樣的溶液的吸光度;Ac 為不加式樣，只加DPPH的溶液的吸光度。

圖1 蘆丁和樣品的吸收曲線Fig.1 Absorption curves of rutin and sample

圖2 DPPH 吸收光譜Fig.2 DPPH absorption spectrum

2.7 叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的IC50值的計算

IC50為半數抑制率濃度，即自由基清除率為50%時的自由基清除劑的濃度。運用Graphpad Prism 5.0 計算IC50。

3 結果與分析

3.1 最大吸收波長的確定

對照品和樣品溶液均在501 nm 波長處有最大吸收峰，故以501 nm 為測定波長(見圖1)。

3.2 叉枝鴉蔥總黃酮的提取

經測定，叉枝鴉蔥總黃酮提取率為2.79 g/100g。

3.3 波長-吸光度之間的關系

測定在乙醇-水介質中的活性時，選擇測定波長為517 nm(見圖2)。

3.4 叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的反應動力學研究結果

不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的反應動力學曲線圖(見圖3)。同時采用Graphpad Prism 5.0 對實驗數據進行方程擬合，數學模型為:Y=(Y0-NS)* exp(-K* X)+NS，其中:Y0 表示最大吸光度;NS 表示當時間達到一定量時，吸光度的最小極值;K 表示吸光度與時間對應的斜率。擬合曲線方程各項數據(見表1)，并歸納5 組擬合曲線方程(見表2)。

圖3 各濃度擬合曲線圖Fig.3 Fitting kinetic curves of different concentrations

表1 動力學數據結果Table 1 Results of kinetics data

表2 動力學曲線方程Table 2 Kinetic curve equation

從圖3 可以看出，不加樣品的DPPH 自由基隨時間的延長其吸光度沒有變化，說明DDPH 是一種穩定的自由基，而加入不同濃度叉枝鴉蔥總黃酮的DPPH 自由基的吸光度隨時間的延長而逐漸降低。在反應前5 min 吸光度下降很快，5 min 后，吸光度下降緩慢，在30～45min 內反應達到基本平衡，該體系的吸光度不再下降。但當叉枝鴉蔥總黃酮濃度越高時，反應達到平衡的時間越短，對照蘆丁、VC亦表現出同樣的反應規律。

圖4 叉枝鴉蔥總黃酮對DPPH 自由基清除率Fig.4 Scavenging rate of flavonoids from S.divaricata on DPPH free radical

3.5 對DPPH 自由基清除率

由圖4 可以看出，叉枝鴉蔥總黃酮對DPPH 自由基有明顯的清除作用，在5～25 μg/mL 的濃度范圍內，叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的能力為41.72%～87.72%。隨著濃度的增加，其對DPPH自由基的清除能力增強，對DPPH 自由基的清除具量效關系。同蘆丁、VC相比，叉枝鴉蔥總黃酮對DPPH 自由基的清除率明顯偏高于蘆丁和VC。

3.6 清除DPPH 自由基的IC50值

經計算，叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 的IC50值為5.6 μg/mL，大于蘆丁IC506.2 μg/mL 和Vc 的IC507.3 μg/mL。說明叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH自由基的效果好于二者。

4 討論

叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的反應動力學研究，根據公式:Y=(Y0-NS)* exp(-K* X)+NS，進行求導，其中一階導數Y'=-(Y0-NS)* K*exp-kx＜0(恒小于零)說明:吸光度隨著時間的增加而減少，而當時間趨于無窮大時，吸光度無限趨近于NS 值。對其進行二階求導，其導數為:Y″=(Y0-NS)* K2* exp-KX＞0(恒大于零)，說明:吸光度隨時間的增加的變化率減小，而當時間趨于無窮大時吸光度隨時間的變化率趨于不變，接近于零值。

根據5、10、15、20、25 μg/mL 擬合曲線圖分析可知，隨著樣品濃度的增加，NS 值逐漸減小，說明樣品濃度對DPPH 的抗氧化性不斷增強。

從動力學數據可以看出，當樣品濃度在5、10、15、20、25 μg/mL 時，所得五個具體曲線方程中Y0值與實際反應值，隨著濃度的增加，差值從0.0025變成零，說明該五組方程表達式均能很好的表達各個濃度樣品的實際反應過程。一個模型五組方程不但本身線性相關性很強，回歸效果好，由于動力學模型方程經參數估值后所得的模擬計算值與實驗值吻合較好，可以作為優化工藝條件的控制依據。

叉枝鴉蔥總黃酮對DPPH 自由基有明顯的清除作用，清除DPPH 自由基的能力隨著濃度的增加而增加，并對DPPH 自由基的清除率具有量效關系。叉枝鴉蔥總黃酮清除DPPH 自由基的IC50值為5.6 μg/mL，是一種有效的自由基清除劑。

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