黑果腺肋花楸花色苷樹脂純化工藝及其穩定性研究

國石磊，朱鳳妹，王 娜，張永祥，李 軍

河北科技師范學院食品科技學院 河北省果品加工工程技術研究中心，秦皇島 066600

黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)屬薔薇科，原產于美國東北部，果皮為紫黑色，果汁為暗寶石紅色，美國和歐洲國家把黑果腺類花楸作為民間的藥材有很長的歷史，果實中含有大量的花色苷類物質［1，2］。食用色素是現代食品工業中的一種重要的食品添加劑，隨著科技的發展和人民生活水平的提高，天然色素的市場需求量不斷增大。花色苷由于其特有的性質可作為天然的著色劑應用于果汁、果酒領域中［3-5］，而花色苷也具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗血栓以及降血脂等多種生物活性［6-10］。李夢莎［11］采用超聲波輔助提取方法提取了黑果腺肋花楸中的花色苷，并用響應面法優化了提取工藝，最優條件下花色苷提取量是39.80 mg/g。Oszmianski J［12］等研究表明，黑果腺肋花楸花色苷占果實酚類化合物的25%左右，果實中含有4 種花色苷單體，即矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-木糖苷。大孔樹脂吸附純化法是目前純化花色苷類色素常用的方法，具有成本低、效率高、操作簡單方便等優點［13，14］。

本實驗目的在于研究黑果腺肋花楸花色苷純化工藝及其穩定性，比較幾種大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸花色苷的吸附解吸效果，篩選出最適的樹脂類型進行動態吸附-解吸實驗，提高花色苷純度。研究其在光照、溫度、pH 值、金屬離子和氧化劑、還原劑的干預下花色苷性質的改變，根據其穩定性差異探尋黑果腺肋花楸花色苷的保存條件。

1 材料與儀器

黑果腺肋花楸由遼寧省海城市世富集團提供，-20 ℃儲存;無水乙醇、濃鹽酸、NaCl、FeSO4、ZnSO4、MgSO4、MnCl2、CuSO4、Alcl3、FeCl3·6H2O、H2O2、Na2SO3、苯甲酸鈉、檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸、磷酸二氫鈉、檸檬酸均為國產分析純;去離子水;BS-80、D101、AB-8、HP-20、HPD-100 大孔吸附樹脂，滄州寶恩化工有限公司。

UV765 紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司制造;低速臺式大容量離心機，無錫市瑞江分析儀器有限公司;KQ5200DB 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;MS204S/01 型電子天平，梅特勒-托利多儀器(瑞士)有限公司;N-1100旋轉蒸發器，日本EYELA;冷凍干燥機，日本EYELA。

2 實驗方法

2.1 黑果腺肋花楸花色苷的提取

以40%的乙醇溶液(含0.1%乙酸)為提取液，提取溫度43 ℃、超聲提取時間23 min、液料比89∶1 mL/g，提取完成后先過濾去皮渣，再以7000 rpm 離心去沉淀，40 ℃旋轉蒸發至膏狀，冷凍干燥得到紫黑色粉末，備用。

2.2 黑果腺肋花楸花色苷純化方法

2.2.1 大孔吸附樹脂的預處理［15］

取5 種適量大孔吸附樹脂，用無水乙醇浸泡24 h 后用蒸餾水反復洗至樹脂無醇味，用質量分數為2%的NaOH 溶液浸泡3 h，蒸餾水洗至中性，再用質量分數為0.5 %的HCl 溶液浸泡3h，蒸餾水洗至中性裝柱備用。

2.2.2 大孔吸附樹脂的篩選

分別稱取1.000 g 經預處理后的樹脂于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL 等質量濃度花色苷液，封口，室溫條件下遮光振蕩(100 rpm)。每隔0.5 h 吸取上清液2 mL 于520 nm 波長處測定吸光度，測定后倒回錐形瓶，直到數值穩定;準確稱取已吸附飽和的樹脂1.000 g 于錐形瓶中。用體積分數為40%乙醇溶液(0.1% 乙酸)分次洗脫，每次洗脫振蕩30 min，速率為100 rpm，洗脫劑用量25 mL。過濾，以相應溶劑作為空白，處測定濾液吸光度A，A 總表示梯度洗脫液吸光度累加，以參數A 總來評價樹脂的解吸效果。吸附率E1/%=［(A0V0-A1V1)/A0V0］× 100，解吸率E2/%=［A2V2/(A0V0-A1V1)］×100，其中A0、A1和A2分別為上樣液吸附前、吸附后和解吸液在520 nm 處的吸光值，V0、V1和V2分別為上樣液吸附前、吸附后和解吸液的體積［16］。

2.2.3 HP-20 樹脂的靜態吸附和解吸動力學研究

準確稱取1.000 g 預處理過的HP-20 大孔樹脂于具塞三角瓶中，加入25 mL 不同pH 值、不同質量濃度的花色苷溶液，每隔0.5 h 吸取上清液2 mL 于534 nm 波長處測定吸光度，測定后倒回三角瓶，直到數值穩定，考察pH、上樣液質量濃度對吸附率的影響，選用最佳的吸附條件，過濾出吸附飽和的樹脂，稱取1.0 g 吸附飽和的樹脂，分別不同體積分數的酸性乙醇(0.5%乙酸)溶液進行洗脫，考察不同體積分數的乙醇對解吸率的影響。

2.2.4 HP-20 樹脂的動態吸附和解吸動力學研究

采用濕法裝柱，選取不同的流速上樣，分段收集流出液測定流出液的吸光值，當流出液吸光值達到泄露點時停止進樣，考察不同吸附流速對吸附率的影響，吸附飽和后，用3 倍柱體積的去離子水沖洗樹脂以去除糖類，用最適體積分數的酸性乙醇(0.5%乙酸)以不同的流速對樹脂進行洗脫，分段收集流出液并測定吸光值，考察不同解吸速度對解吸率的影響。

2.2.5 HP-20 大孔吸附樹脂純化效果檢測方法及回收率

精確稱取花色苷樣品，用pH 為3 的檸檬酸-磷酸鹽的緩沖溶液定容至100 mL，以緩沖溶液為空白調零，在520 nm 下測定吸光值;色價=A ×100/m，式中A 為520 nm 下花色苷溶液的吸光值，m 為花色苷的質量;回收率(%)=C1V1/C0V0×100，式中C0、C1為上樣液吸附前和解吸液的花色苷質量濃度，V0、V1為上樣液吸附前和解吸液的體積，3 次平行實驗。

2.3 黑果腺肋花楸花色苷穩定性研究方法

2.3.1 pH 對花色苷穩定性的影響

用檸檬酸和磷酸二氫鈉配制pH 值為1～10 的緩沖溶液，精確稱取適量純化后花色苷提取液分別加入不同pH 值的緩沖溶液，搖勻，以相應的pH 值緩沖溶液做調零，在520 nm 下測定吸光值，并觀察記錄顏色的變化情況。

2.3.2 光照條件對花色苷穩定性的影響

精確稱取適量純化后花色苷固體裝入兩個具塞試管中，向其中分別加入蒸餾水20 mL(含0.5%乙酸)，在避光和實驗室自然光下，在1～10 d 內定時取樣，測定花色苷溶液在520 nm 下的吸光值。

2.3.3 溫度對花色苷穩定性的影響

精確取5 份純化后的花色苷固體，加入蒸餾水(含0.5 %乙酸)定容至30 mL，分別置于30、40、50、60、70 ℃的恒溫水浴鍋中，每隔30 min 取樣，取樣時迅速冷卻至室溫后，在520 nm 處測定吸光值。

2.3.4 金屬離子對花色苷穩定性的影響

分別配制濃度為0.5 mol/L 的NaCl、FeSO4、Zn-SO4、MgSO4、MnCl2、CuSO4溶液，取純化后的花色苷溶液5 mL 與10 mL 上述溶液混勻，以5 mL 去離子水和相應的10 mL 鹽溶液混勻做為參比調零，每隔5 h 測定其在520 nm 下的吸光值。

2.3.5 氧化劑和還原劑對花色苷穩定性的影響

分別配制不同濃度為的H2O2水溶液和Na2SO3溶液，取純化后的黑果腺肋花楸花色苷提取液5 mL與10 mL 上述溶液混勻，以5 mL 去離子水和相應的10 mLNa2SO3和H2O2溶液混勻做為參比調零，搖勻后在520 nm 測定溶液的吸光值。

3 結果與分析

3.1 黑果腺肋花楸花色苷的純化

3.1.1 大孔吸附樹脂的篩選

不同型號的大孔吸附樹脂的吸附曲線和解吸曲線和性能如圖1 和表1 所示。由圖1 和表1 可以得出，樹脂的孔徑對花色苷的吸附效果影響較大，孔徑過小或過大都不利于花色苷分子的保留［17］，非極性的樹脂比弱極性的樹脂對黑果腺肋花楸花色苷的吸附和解吸效果都好，大孔吸附樹脂在90 min 時基本吸附飽和，解吸過程在60 min 時結束，其中HP-20的吸附和解吸能力最強，吸附率達到91.2%，解吸率為90.1%，因此選擇HP-20 大孔吸附樹脂進行黑果腺肋花楸花色苷的純化樹脂。

圖1 不同大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸花色苷的吸附(A)及解吸(B)效果Fig.1 Adsorption (A)and desorption (B)curves of anthocyanins on different resins

表1 不同大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸花色苷吸附和解吸性能的比較Table 1 Comparison of adsorption and desorption efficiencies of A.melanocarpa anthocyanins with different resins

3.1.2 HP-20 大孔吸附樹脂的靜態吸附特性

3.1.2.1 樣液pH 值對吸附效果的影響

花色苷溶液在酸性條件下能夠穩定的存在，在堿性條件下會有降解現象的出現，試驗考察了花色苷溶液在酸性條件下pH 值與HP-20 大孔吸附樹脂的吸附能力。由圖2 可知，花色苷溶液pH 值為1時，樹脂的吸附率最高達到92.6%，隨著pH 值的升高，樹脂的吸附能力有下降趨勢，可能是黑果腺肋花楸花色苷隨著pH 值的改變其在溶液的存在形式也會發生變化，pH 為1 和2 時解吸效果相差不大，而且過酸性的溶液對大孔吸附樹脂和儀器會產生不利影響［18］，所以選擇pH 值為2 的黑果腺肋花楸花色苷溶液做為最佳的動態上樣液pH 值。

圖2 黑果腺肋花楸花色苷溶液pH 值對HP-20 大孔吸附樹脂吸附的影響Fig.2 Adsorption performances of A.melanocarpa anthocyanins with different pH values on HP-20 resins

3.1.2.2 樣液質量濃度對吸附效果的影響

由圖3 可知，隨著上樣液質量濃度的增大，HP-20 大孔吸附樹脂的吸附效果逐漸降低，這是由于大孔吸附樹脂對花色苷的吸附能力有限，當上樣液中含有過多的花色苷時吸附樹脂的吸附能力達到飽和而導致的吸附率降低，雖然質量濃度為0.3 mg/mL時的吸附率要略高于0.6 mg/mL，但是后者溶液中所含花色苷濃度大，當上樣液質量濃度高于0.6 mg/mL 時，大孔吸附樹脂的吸附效果急劇下降，會造成原料的浪費，充分利用樹脂和節省原料的角度上考慮，選擇上樣液質量濃度為0.6 mg/mL。

圖3 黑果腺肋花楸花色苷溶液質量濃度對HP-20 大孔吸附樹脂吸附的影響Fig.3 Adsorption performances of different concentrations of A.melanocarpa anthocyanins solution on HP-20 resins

3.1.2.3 不同體積分數乙醇對解吸效果的影響

解吸的過程實質上是解吸液與花色苷爭奪大孔吸附樹脂活性吸附點的過程，不同體積分數的乙醇溶液可以導致洗脫劑的極性大小不同，這樣會影響黑果腺肋花楸花色苷與大孔吸附樹脂之間的相互作用力，如圖4 所示，在一定范圍內，隨著洗脫劑乙醇的體積分數增大，解析效果逐漸增強，當體積分數大于40%時解吸效果有下降的趨勢，考慮解吸效果和成本，選擇體積分數為40%的乙醇(含0.5%乙酸)作為解吸液。

圖4 乙醇濃度對HP-20 大孔吸附樹脂解吸的影響Fig.4 Effect of ethanol concentrations on HP-20 resins desorption behavior

3.1.3 HP-20 大孔吸附樹脂的動態吸附特性

3.1.3.1 動態吸附流速的確定

上樣液的流速對大孔吸附樹脂的吸附效果有很大的影響，不同的流速導致花色苷向大孔吸附樹脂表面擴散速度不同，泄漏點出現的早晚是評價動態吸附流速對大孔吸附樹脂吸附效果影響的重要指標，由圖5 可以得出，上樣液流速越快，泄露點出現的越早;隨著流速的降低，泄露點的出現也有相應的延遲，當吸附速率為2.5 mL/min 時，在流出20 管的時候就已泄漏，而流速為0.5 mL/min 和1.0 mL/min 時泄露點均在45 管左右出現，流速小延長了吸附時間使樹脂的壽命降低，因此在后續的試驗中選擇上樣液流速為1.0 mL/min。

圖5 黑果腺肋花楸花色苷溶液流速對HP-20 大孔吸附樹脂吸附的影響Fig.5 Effects of different flow rates on the adsorption of A.melanocarpa anthocyanins with HP-20 resin

3.1.3.2 解吸液流速的確定

由圖6 可知，在解吸液流速大于1.0 mL/min時，洗脫峰型都較寬，出現嚴重的拖尾現象，這是由于隨著解吸液流速的增大，只有較少的花色苷類物質溶解在解吸液中被洗脫下來，需要大量的解吸液才能將大部分花色苷解吸下來，當解吸液的流速小于1.0 mL/min 時，兩個流速下的峰型較窄，這是由于吸附在樹脂上的花色苷類物質有充分的時間溶解在解吸液中，考慮到洗脫時間、解吸液用量和洗脫效果，選取解吸液流速為1.0 mL/min。

圖6 解析液流速對HP-20 大孔吸附樹脂解吸的影響Fig.6 Effect of different elution rate on the desorption of HP-20 resin

3.1.3.3 HP-20 大孔吸附樹脂純化效果檢測方法及回收率

選用HP-20 大孔吸附樹脂在最佳純化條件下，黑果腺肋花楸花色苷色價由開始的14.3 提高到121.5，是純化前的的8.5 倍，實驗測得花色苷回收率為90.5%。

3.2 黑果腺肋花楸花色苷的穩定性研究

3.2.1 pH 值對花色苷穩定性的影響

由表2 可知，隨著溶液的pH 的增大，最大吸收波長也隨之增大，最大吸收峰出現了明顯的紅移，在pH 值為5 和6 的時候無明顯最大波長，當pH 值大于7 的時候，花色苷溶液呈現出淺褐色。隨著pH的改變，花色苷的降解反應屬一級動力學反應中的裂解反應［19］。結果說明，黑果腺肋花楸花色苷會隨著介質pH 的變化而產生色澤消退和顏色改變［20］，適宜在偏酸性的環境保藏和使用。

表2 pH 值對黑果腺肋花楸花色苷穩定性的影響Table 2 Effects of pH values on the spectral property and the stability of A.melanocarpa anthocyanins

3.2.2 光照條件對花色苷穩定性的影響

由圖7 可知，黑果腺肋花楸花色苷在實驗室自然光條件下，花色苷溶液吸光值逐漸下降，說明花色苷發生了明顯的降解，而在避光條件下10 天內溶液吸光值沒有太大變化，因此，黑果腺肋花楸花色苷應該盡量避光儲藏。

圖7 光照和避光對黑果腺肋花楸花色苷穩定性的影響Fig.7 Effects of sunlight and dark on the stability of A.melanocarpa anthocaynins

3.2.3 溫度對花色苷穩定性的影響

由圖8 所示，隨著處理溫度的升高和時間的延長，黑果腺肋花楸花色苷的吸光值在下降，處理溫度40、50、60 ℃與70、80 ℃相比，黑果腺肋花楸花色苷吸光度下降比較小。處理2h 后，40、50、60 ℃的花色苷保存率為99.5%、99.2%、98.0%，而70、80 ℃下花色苷的保存率只有70.8%和67.7%，可見黑果腺肋花楸花色苷在60 ℃以內，顯示了較強的耐熱性，處理溫度不斷加大，其耐熱性降低，顏色由鮮紅變淺，因此，黑果腺肋花楸花色苷類產品在加工過程中溫度應該控制在60 ℃以下。

圖8 溫度對黑果腺肋花楸花色苷穩定性的影響Fig.8 Effects of temperature on the stability of A.melanocarpa anthocaynins

3.2.4 金屬離子對花色苷穩定性的影響

由表3 所示，Na+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+的鹽離子加入到黑果腺肋花楸花色苷溶液中后，溶液的吸光值變化不大，可以確定這幾種鹽離子對花色苷的穩定性無明顯影響，而Cu2+、Al3+、Fe3+的加入使花色苷溶液的吸光值顯示出下降的趨勢，這可能是由于花色苷分子與這些金屬離子結合，形成復雜的絡合物導致花色苷的降解，因此，在黑果腺肋花楸花色苷在加工過程中應該避免添加這些離子的試劑，以起到增加花色苷穩定性的效果。

表3 金屬離子對黑果腺肋花楸花色苷穩定性的影響Table 3 Effects of metal ions on the stability of A.melanocarpa anthocaynins

3.2.5 氧化劑和還原劑對花色苷穩定性的影響

由表5 可知，氧化劑H2O2的加入后，黑果腺肋花楸花色苷溶液的吸光值明顯下降，目測花色苷溶液顏色由深紅色變為無色，氧化劑濃度越大，花色苷溶液的吸光值越低，這是由于花色苷屬于多酚類天然產物，結構里含有酚羥基，容易受到氧化劑的氧化而導致花色苷的降解［21］;在花色苷溶液中加入不同濃度的還原劑Na2SO3之后，目測觀察花色苷溶液由深紅色變為淺紅，隨著濃度的增大，花色苷溶液變為無色，因此，無論是氧化劑還是還原劑對黑果腺肋花楸花色苷穩定性的影響都是極其快速的，在相關黑果腺肋花楸花色苷產品的制作過程中，應避免氧化劑和還原劑的使用。

表5 氧化劑和還原劑對黑果腺肋花楸花色苷穩定性的影響Table 5 Effects of oxidant and reductant on the stability of A.melanocarpa anthocaynins

4 結論

HP-20 大孔吸附樹脂對黑果腺肋花楸花色苷顯示出了優良的純化功能，經純化后花色苷的色價達到121.5，回收率為90.5%，其純化工藝參數為:上樣液pH 為2，上樣液質量濃度為0.6 mg/mL，解吸液為體積分數是40%的酸化乙醇(含0.5%乙酸)，吸附和解吸流速均為1 mL/min。黑果腺肋花楸花色苷對光、pH 值、溫度均表現出負相關的變化趨勢，相關產品加工過程中應盡量避免與Cu2+、Al3+、Fe3+金屬離子和氧化劑、還原劑的接觸，根據相關穩定性試驗，可以認為黑果腺肋花楸花色苷可以應用與酸性、低溫的加工環境中的天然色素資源。

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