喉咽清口服液中齊墩果酸-28-O-β-D吡喃葡萄糖苷在大鼠體內的藥代動力學研究

李躍輝 謝誼 王銀 唐純玉 彭艷梅.湖南省中醫藥研究：楊永華名老中醫藥專家傳承工作室，湖南長沙40006；.湖南時代陽光藥業股份有限公司，湖南永州406

喉咽清口服液中齊墩果酸-28-O-β-D吡喃葡萄糖苷在大鼠體內的藥代動力學研究

李躍輝1謝誼1王銀1唐純玉2彭艷梅1
1.湖南省中醫藥研究：楊永華名老中醫藥專家傳承工作室，湖南長沙410006；2.湖南時代陽光藥業股份有限公司，湖南永州410116

目的研究喉咽清口服液膜濾前后齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷在大鼠體內的藥代動力學特征。方法血漿樣品經乙腈處理，采用HPLC法測定血藥濃度，色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm），流動相：乙腈∶0.4%磷酸（34∶66），流速：1.0 mL/min，檢測波長：203 nm。采用DAS 2.1藥代動力學軟件擬合處理，計算齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷的主要藥代動力學參數。結果齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷在0.0025～0.0500 μg/mL范圍內線性關系良好（r=0.9991），回收率為87.72%～90.37%。喉咽清口服液膜濾前后，齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷的體內過程均符合一房室模型，Tmax分別為（1.002±0.009）、（1.002±0.006）h；Cmax分別為（0.5006±0.1080），（0.4932±0.1210）μg/L；t1/2α分別為（2.159±0.012），（2.312±0.009）h；AUC（0～6）分別為（1.338±0.031），（1.312±0.046）μg/（L·h）；AUC（0～∞）分別為（2.181±0.042），（2.161±0.050）μg/（L·h）。結論喉咽清口服液膜濾前后，齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷在體內的吸收及生物利用度無顯著性變化。

喉咽清口服液曰齊墩果酸-28-O-β-D吡喃葡萄糖苷曰藥代動力學曰高效液相色譜法

“喉咽清口服液”來源于民間秘方，由土牛膝、馬蘭草等藥味組成，為湖南時代陽光藥業股份有限公司自主研制開發的國家級新藥，具有清熱解毒，利咽止痛的功效，主要用于肺胃實熱所導致的咽部腫痛、發熱、口渴、便秘、扁桃體炎、咽炎等證［1-2］。土牛膝具有清熱解毒、活血通經的功效，其水提液具有抗咽喉炎的藥理作用，臨床常用于咽喉腫痛、風濕病、經閉、跌打損傷等癥［3］，從土牛膝中提取分離得到具有較強抗HBV作用的齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷［4］。喉咽清口服液原生產工藝中存在貯存期間有少量沉淀產生、澄清度不夠好等問題,新工藝研究中采取膜濾純化工藝，澄清度等問題得到改善［5］。本研究建立了經膜處理喉咽清口服液大鼠血漿中齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷HPLC測定方法，研究大鼠灌胃給予經膜處理喉咽清口服液的藥代動力學特征，并與膜濾前喉咽清口服液進行比較，為喉咽清口服液的工藝研究、體內研究和臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國HP公司）；LG10-2.4A高速離心機（北京醫用離心機廠）；HHS-4S電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海市南陽儀器有限公司）；BS-1103電子天平（余姚金諾天平儀器廠）；XK96-A快速混勻器（江蘇姜堰市新康儀器廠）；微量移液器（上海榮泰生化工程有限公司）。

1.2 試藥

齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷對照品（湖南省藥品檢驗所）；甲醇（色譜純，迪馬公司）；水為重蒸水；肝素取血管（西安化學試劑廠）；其他試劑均為分析純；膜濾前喉咽清口服液、膜濾后喉咽清口服液（湖南時代陽光藥業股份有限公司，批號均為：20120922）；膜濾后喉咽清口服液制備方法為藥材煎煮液減壓濃縮（溫度60～70℃，真空度-0.06～-0.08 MPa）至相對密度約1.02（60℃），通過孔徑為0.45 μm的管式陶瓷膜，再匯聚在集水管中得到澄清透亮的液體。

1.3 實驗動物

健康SD大鼠，雄性，體重180～220 g，由中南大學實驗動物有限公司提供，生產許可證號：SCXK（湘）2011-0003。

2 方法及結果

2.1 色譜條件[6-7]

固定相：C18（250 mm×4.6 mm）色譜柱，柱溫：35℃；流動相：乙腈∶0.4%磷酸（34∶66）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm。

2.2 血漿樣品采集

取20只健康SD大鼠，隨機分為兩組，每組10只，實驗前禁食12 h，自由飲水，再分別灌胃給予喉咽清膜濾前口服液濃縮液和喉咽清膜濾后口服液濃縮液，給藥量為2 mL。分別于0 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h時間點對大鼠眼眶取血，采樣過程中注意給動物補充適當水分［8］。血樣于肝素化的試管內，5000 r/min離心5 min，取血漿于-20℃低溫保存。

2.3 樣品處理

用微量加樣器精取凍融血漿0.5 mL，置具塞離心管中，精密加入乙腈2 mL旋混60 s，5000 r/min離心10 min，精取上層乙腈，約60℃水浴中用氮氣吹干，用100 μL甲醇溶解殘留物，進樣20 μL。

2.4 對照品溶液的配制

精密吸取齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷對照品溶液，加甲醇配制成0.025 mg/mL的標準母液，密封保存于冰箱待用。

2.5 方法學實驗[9-11]

2.5.1 方法的專屬性考察取受試大鼠空白血漿、加入一定濃度的齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷對照品溶液的空白血漿、大鼠給藥后的血漿樣品，按“2.3”項操作，進樣20 μL，得大鼠血漿的色譜圖（圖1）。結果表明，齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷在22 min左右出峰，血漿中內源性成分對測定無干擾。

2.5.2 血漿標準曲線的制備取大鼠空白血漿，精密加入適量齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷標準溶液，配制成齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷濃度分別為0.25、1.25、2.5、5.0 μg/mL的對照品血漿溶液，按“2.3”項操作，進樣20 μL，記錄色譜圖。以齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程：y=3644.9x+1054.4，r=0.9991。結果表明，齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷濃度在0.0025～0.0500 μg/mL濃度范圍內，與峰面積線性關系良好。

2.5.3 精密度實驗取大鼠空白血漿，精密加入適量齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷標準溶液，配制成相當于齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷濃度分別為0.25、1.25、5.00 μg/mL低、中、高濃度的血漿樣品，按“2.3”項操作，進樣20 μL，進行日內、日間精密度實驗，測定樣品峰面積，每個濃度5份平行樣本。齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷低、中、高濃度的血漿樣品的日內、日間精密度（RSD）均低于10.0%。見表1。

2.5.4 回收率實驗取大鼠空白血漿，配制齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷濃度為0.25、1.25、5.00 μg/mL低、中、高濃度的血漿樣品，同時將相同濃度的血漿樣品在同一天按“2.3”項操作，進樣20 μL，測定樣品峰面積，每個濃度5份平行樣本。齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷平均回收率分別為87.72%、89.44%、90.37%，RSD分別為4.14%、3.28%、3.62%。見表2。

圖1 喉咽清口服液HPLC圖譜

表1 齊墩果酸-28-O-β-D吡喃葡萄糖苷精密度日內、日間結果（n=5，%）

表2 齊墩果酸-28-O-β-D吡喃葡萄糖苷回收率實驗結果（n=5）

2.5.5 檢測限測定用空白血漿配制濃度為1、3、5 ng/mL的齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷的血漿樣品，按“2.3”項操作，進樣20 μL，以信噪比（S/N）時的血清濃度判定本分析方法的檢測限。實驗得知，濃度3 μg/L的含藥大鼠血清的HPLC色譜圖符合S/N=3的條件，故確定本法的檢測限為齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷血清濃度3 μg/L。

2.6 體內藥代動力學實驗[12-13]

2.6.1 血藥濃度-時間曲線的繪制取不同時間點的血漿樣本，按“2.3”項操作，進樣20 μL，測定血漿中齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷的濃度。以時間為橫坐標，齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷濃度為縱坐標，繪制血藥濃度-時間曲線。見圖2。

圖2 齊墩果酸-28-O-β-D吡喃葡萄糖苷血藥濃度-時間曲線

2.6.2 藥代動力學參數計算采用中國藥理學會數學藥理委員會編制的DAS 2.1.藥代動力學軟件，擬合藥代動力學模型，對血藥濃度-時間數據進行房室模型判別，以最小AIC判斷，膜濾前后喉咽清口服液中齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷在大鼠體內的吸收均為一房室模型，權重系數為1。主要藥代動力學參數見表3。

表3 齊墩果酸-28-O-β-D吡喃葡萄糖苷的藥代動力學參數

3 討論

3.1 方法學分析

本試驗建立了血漿中齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷的HPLC測定法，樣品直接用乙腈沉淀蛋白，不需分離提取等，處理簡單，方法快速準確，同時亦考察了該方法的方法學。結果表明，血漿中雜質不干擾樣品的測定，線性關系良好（r=0.9991）；最低檢測限為3 ng/mL；平均回收率89.38%；日間差、日內差均小于10.0%，符合生物樣本的分析要求，故該方法可作為含齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷中成藥的血藥濃度檢測手段。

3.2 藥代動力學分析

經計算機擬合，經灌胃1 h后，膜濾前后喉咽清口服液中齊墩果酸-28-O-β-D喲喃葡萄糖苷均可達到最大血藥濃度，其Cmax分別為（0.5006±0.1080）、（0.4932±0.1210）μg/L，其藥-時曲線下面積分別為（2.181± 0.042）、（2.161±0.050）μg/（L·h）；說明經膜處理后，樣品達峰時間未有變化，血藥濃度有所降低，故可知喉咽清口服液經膜濾處理之后，其主要成分保留，含量略有降低，但不影響其在體內的藥代動力學行為。其t1/2α分別為（2.159±0.012）、（2.312±0.009）h，表明其在體內吸收較快，維持穩定治療血藥濃度的時間比較短［14］，為臨床用藥提供了一定的參考依據。

3.3 膜分離技術分析

中藥口服液常含有一些高分子雜質，如淀粉、樹膠、果膠、色素、鞣質、黏液質等，它們在藥液中常呈膠體分散或相互增溶狀態，在滅菌、貯存過程中，因溶劑系統、溫度、pH值等的改變而聚集沉淀，使藥液澄明度受到影響［15］。喉咽清口服液將膜分離技術應用于純化工藝中，不僅改善了其澄明度，且其有效成分損失少，為膜分離技術應用于復方中藥提取液的大生產提供了參考價值。

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Pharmacokinetic study of Oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside in Houyanqing Oral Liquids in rats

LI Yuehui1XIE Yi1WANG Yin1TANG Chunyun2PENG Yanmei1
1.Yang Yonghua Famous Chinese Medicine Experts Inheritance Studio,Hu'nan Academy of Chinese Medicine,Hu'nan Province,Changsha410006,China;2.Hu'nan Era Sunshine Pharmaceutical Co.Ltd.,Hu'nan Province,Yongzhou 410116,China

ObjectiveTo study the pharmacokinetic characteristics of Oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside before and after the membrane filtration in Houyanqing Oral Liquids in rats.MethodsThe plasma samples were pretreated by acetonitrile,then drug concentrations were determined by HPLC method，the analytes were separated on a C18column(250 mm×4.6 mm);mobile phase:acetonitrile∶0.4%phosphoric acid(34∶66),the flow rate:1 mL/min,the eluent: 203 nm.The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2.1.ResultsThe linear range of Oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside was 0.0025-0.0500 μg/mL(r=0.9991),and the recovery rate was 87.72%-90.37%.The Oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside process was conformed to the atrioventricular model in the body before and after the membrane filtration in Houyanqing Oral Liquids.Tmaxwere(1.002±0.009),(1.002±0.006)h;Cmaxwere(0.5006± 0.1080),(0.4932±0.121)μg/L;t1/2α were(2.159±0.012),(2.312±0.009)h;AUC(0-6)were(1.338±0.031),(1.312±0.046)μg/(L·h); AUC(0-∞)were(2.181±0.042),(2.161±0.050)μg/(L·h).ConclusionBefore and after the membrane filtration in Houyanqing Oral Liquids,Oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside in the body of the absorption and bioavailability doesn't significantly change.

Houyanqing Oral Liquids;Oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranoside;Pharmacokinetic;HPLC

R286.0

A

1673-7210（2015）07（a）-0015-04

2015-01-08本文編輯：蘇暢）

湖南省戰略性新興產業重大科技攻關項目（湘財企指［2012］155號）。

李躍輝（1978-），女，副研究員，主要從事于中藥制劑與分析工作。

彭艷梅（1973-），女，博士，副研究員，主要從事于中藥制劑與分析工作。