硫氧環蛋白過氧化物酶3在血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥大中的表達

梁婷婷 裴強 王洪波 范玉磊 魏中秋 馮莉 孫影▲.河北聯合大學基礎醫學：病理學系，河北唐山06000；.河北聯合大學附屬遵化市人民醫：心內科，河北唐山06400；.河北聯合大學附屬遵化市人民醫：外科，河北唐山06400

硫氧環蛋白過氧化物酶3在血管緊張素Ⅱ誘導心肌肥大中的表達

梁婷婷1裴強2王洪波3范玉磊1魏中秋1馮莉1孫影1▲
1.河北聯合大學基礎醫學：病理學系，河北唐山063000；2.河北聯合大學附屬遵化市人民醫：心內科，河北唐山064200；3.河北聯合大學附屬遵化市人民醫：外科，河北唐山064200

目的觀察硫氧環蛋白過氧化物酶3（Prdx-3）在血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導心肌細胞肥大中的表達。方法體外培養心肌細胞（H9C2）隨機分為對照組和AngⅡ組（AngⅡ1×10-6mol/L處理）。Real time PCR法檢測腦鈉素（BNP）mRNA表達，二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測活性氧（ROS）水平，Western blot法檢測Prdx-3蛋白表達。結果①與對照組比較，AngⅡ刺激6、12、24、48 h的BNP mRNA分別增長（1.10±0.08）、（1.30±0.18）、（1.80± 0.25）、（2.00±0.37）倍，除刺激6 h外，其他時間點的差異均有統計學意義（P＜0.05）。②AngⅡ刺激5、10、20、40 min和1 h ROS水平分別是（3740±75）、（3911±91）、（4330±143）、（4073±335），（3879±226），與對照組（3426±197）比較，刺激5、10、20 min時差異有統計學意義（P＜0.05）。③AngⅡ刺激30 min、1 h、3 h和6 h時Prx-3蛋白的表達值分別為（0.72±0.11）、（0.50±0.07）、（0.42±0.08）和（0.35±0.08），與對照組（0.33±0.05）比較，AngⅡ刺激30 min和1 h時差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論在AngⅡ誘導心肌細胞肥大過程中伴隨著Prdx-3表達的上調，推測Prdx-3表達與降低ROS有關。

硫氧環蛋白過氧化物酶3；活性氧；心肌肥大；血管緊張素Ⅱ

高血壓是以動脈血壓持續性增高為主要特征的一種常見慢性疾病，晚期累及心臟，造成高血壓性心臟病。高血壓性心臟病主要病理表現是心肌肥大，但持續性心肌肥大會導致心力衰竭，最終引起患者死亡。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是誘導高血壓的重要物質之一，可在高血壓心臟微環境中表達增高，作用于心肌細胞，造成心肌細胞肥大［1］。硫氧環蛋白過氧化物酶3（peroxiredoxin-3，Prdx-3）是一種新型過氧化物酶，存在于線粒體，與硫氧還蛋白2（Trx-2）一起清除來自于線粒體的活性氧（ROS）［2］。研究顯示Prdx-3在多種病理過程中均表達上調，發揮機體保護作用［3］。ROS在肥大的心肌中表達升高，但同時是否Prdx-3可被反應性地激活，目前報道較少。本研究利用體外培養的心肌細胞，觀察Prdx-3在AngⅡ誘導心肌肥大中的表達，為深入探究Prdx-3在心肌肥大中的作用及成為高血壓心臟病靶向治療新靶點提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

H9C2大鼠心肌細胞（中國科學：上海生命科學研究：提供）；血管緊張素Ⅱ（Sigma公司）；腦鈉素上下游引物（上海吉瑪公司）；M-MLV逆轉錄試劑盒、SYBR+Tap混合劑（美國invitrogen公司）；二氯熒光素二乙酸（Sigma公司）；Prdx-3抗體（Abcam產品）。

1.2 細胞培養及實驗分組

心肌細胞在含10%胎牛血清濃度的杜爾伯科改良伊格爾培養基（DMEM）中常規培養。細胞在達到70%融合后，給予0.4%血清濃度DMEM培養12 h，使細胞同步化，然后隨機分為對照組（僅0.4%血清濃度DMEM）和AngⅡ組（經AngⅡ1×10-6mol/L處理）。

1.3 Real time PCR法檢測腦鈉素（BNP）mRNA表達[4]

細胞未經或經AngⅡ刺激6、12、24、48 h，棄培養液，利用Trizol提取細胞總RNA,定量后取0.5 μg RNA行逆轉錄。取1 μL cDNA進行Real-time PCR擴增，擴增體系如下：SYRB+Taq混合劑10 μL，Prx-1或GAPDH上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水8 μL；擴增條件：95℃變性30 s后，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。BNP上游引物序列5'TGGGCAGAAGATAGACCGGA 3'，下游5'ACAACCTCAGCCCGTCACAG 3'；GAPDH上游引物5'GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG3'，下游引物5'ATGGTGGTGAAGACGCCAGTAA 3'。GAPDH為內參照，各組BNP mRNA表達量以各樣本與對照組的倍數表示。

1.4 二氯熒光素二乙酸（DCFH-DA）檢測ROS水平

DCFH-DA沒有熒光，能自由穿過細胞膜，進入細胞后被酯酶水解生成還原型二氯熒光素（DCFH），DCFH不能通過細胞膜，但可被細胞內的ROS氧化生成氧化型二氯熒光素（DCF），DCF可發出熒光。因此DCF的熒光量可以反映細胞內ROS水平。本實驗中，AngⅡ刺激心肌細胞0、5、10、20、40 min和1 h，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，加入DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L，37℃孵育20 min后，PBS洗3次，去掉未進入細胞內的DCFH-DA，計數10 000個細胞，熒光酶標儀測定激發波長488 nm，發射波長525 nm處的熒光強度。

1.5 Western blot法檢測Prdx-3蛋白表達

細胞經或未經AngⅡ刺激30 min、1 h、3 h和6 h，棄培養液，PBS漂洗，細胞裂解液冰上震蕩裂解30 min，收集裂解細胞，低溫高速離心15 min，收集上清，-70℃保存。以考馬斯亮藍R-250染色測定蛋白濃度，每孔50 μg上樣并電泳、轉膜。5%牛血清白蛋白封閉1 h，Prdx-3抗體（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。二抗（1∶3000稀釋），室溫孵育2h。BCIP/NBT（1∶50稀釋）顯色3 min。Image J軟件對蛋白表達條帶進行灰度定量分析，以Prdx-3與GAPDH灰度比值作為Prdx-3表達值。

1.6 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；重復測量的計量資料比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BNP mRNA表達

與對照組比較，AngⅡ刺激6、12、24、48 h的BNP mRNA分別增長（1.10±0.08）、（1.30±0.18）、（1.80± 0.25）、（2.00±0.37）倍，除AngⅡ刺激6 h外，其他刺激時間點的比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 ROS水平

對照組的ROS水平為（3426±197），AngⅡ刺激5、10、20、40 min和1 h ROS水平分別是（3740±75）、（3911± 91）、（4330±143）、（4073±335），（3879±226）。與對照組比較，AngⅡ刺激5、10、20 min時ROS水平的差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 Prdx-3蛋白表達

對照組Prdx-3蛋白的表達值為（0.33±0.05），AngⅡ刺激30 min、1 h、3 h和6 h時Prdx-3蛋白的表達值是（0.72±0.11）、（0.50±0.07）、（0.42±0.08）和（0.35± 0.08）。與對照組比較，AngⅡ刺激30 min和1 h時的差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blot法檢測細胞Prdx-3蛋白表達情況

3 討論

BNP雖然首先是從豬腦中分離出來的，但其合成主要在心室肌細胞，并分泌入血［5］。研究顯示BNP在高血壓心肌肥大中表達增高，是心肌肥大標志性活性多肽分子［6-9］。

ROS包括氧自由基、過氧化物和激發態氧等，具有很高的化學活性。正常時體內ROS的濃度很低，對機體具有保護作用，但過多的ROS可導致脂質過氧化、DNA鏈斷裂、蛋白質修飾變性，從而導致細胞凋亡和壞死［10］。筆者前期研究顯示自于線粒體的ROS介導了高血壓誘導心肌肥大和心功能下降［11］。最近報道也證實心臟微環境內的腎素-血管緊張素-醛固酮系統通過誘導ATP依賴的鉀離子通道開放促進線粒體產生更多ROS，并由此引起Ⅰ型鈉氫交換體和碳酸氫鈉協同轉運蛋白的激活，最終導致心肌細胞肥大［1］。而Prdx-3是一種新型的過氧化物酶，是該家族成員中唯一特異性定位于線粒體的酶蛋白。Prdx-3、Trx2及硫氧還蛋白還原酶2（TrxR2）一起構成Prdx-3-Trx-TrxR氧化還原體系，催化來自線粒體的過氧化氫（H2O2）轉變成H2O，從而調控線粒體內H2O2濃度水平，保護細胞存活、生長和增殖［12］。如有研究顯示，來源于線粒體的ROS促進了惡性間皮瘤細胞合成Prdx-3蛋白，以降低細胞內過高的H2O2濃度，使細胞更易于生長和增殖［11］。另外，Prdx-3高表達能夠減輕毒物誘導的大鼠海馬區神經的損傷和保護肝癌細胞免于氧化應激誘導的細胞凋亡［13-15］。

本研究利用AngⅡ作用于心肌細胞，發現在AngⅡ刺激12 h時，BNP mRNA的表達開始增高，隨后隨著刺激時間延長，表達逐漸增高，具有時效性，說明AngⅡ上調BNP基因的表達，刺激了心肌細胞肥大。另外，AngⅡ作用5 min時心肌細胞ROS的水平即開始增高，20 min時達到高峰，說明AngⅡ可刺激心肌細胞快速產生ROS；同時我們還發現AngⅡ刺激心肌細胞30 min時，Prdx-3蛋白表達明顯高于對照組，隨后表達有所下降，提示AngⅡ還能快速上調心肌細胞Prdx-3表達。推測Prdx-3蛋白在心肌細胞的快速上調可能與降低AngⅡ誘導的ROS有關，但其后期表達不足可能會促進心臟的氧化應激，因此提高Prdx-3的表達可能成為抑制高血壓心肌肥大的新途徑之一。

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Expression of peroxiredoxin-3 in angiotensinⅡinducing cardiomyocytes hypertrophy

LIANG Tingting1PEI Qiang2WANG Hongbo3FANG Yulei1WEI Zhongqiu1FENG Li1SUN Ying1▲
1.Department of Pathology Primary Medicine College,Hebei United University,Hebei Province,Tangshan063000, China;2.Department of Cardiology,Zunhua People's Hospital Affiliated to Hebei United University,Hebei Province,Tangshan064200,China;3.Department of Surgery,Zunhua People's Hospital Affiliated to Hebei United University,Hebei Province,Tangshan064200,China

ObjectiveTo observe the expression of peroxiredoxin-3(Prdx-3)in AngiotensinⅡ(AngⅡ)inducing cardiomyocytes hypertrophy.MethodsCultured cardiomyocytes were randomly divided into control group and AngⅡgroups(dealed with AngⅡ1×10-6mol/L).BNP mRNA and reactive oxygen species(ROS)were measured by Realtime PCR and DCFH-DA;while Prdx-3 expression was by Western blot.Results①Compared with control group,BNP mRNA expression increased(1.10±0.08),(1.30±0.18),(1.80±0.25),(2.00±0.37)times respectively when AngⅡstimulated at 6,12,24,48 h,except at 6 h,the differences were statistically significant(P＜0.05).②The level of ROS in control group was(3426±197),ROS increased to(3740±75),(3911±91),(4330±143),(4073±335),(3879±226)respectively when AngⅡstimulated at 5,10,20,40 min and 1 h,compared with control group,the differences were statistically significant(P＜0.05).③The level of Prdx-3 in control group was(0.33±0.05),Prdx-3 increased to(0.72±0.11), (0.50±0.07),(0.42±0.08),(0.35±0.08)when AngⅡstimulated at 30 min,1 h,3 h and 6 h,compared with control group, the differences of AngⅡstimulated at 30 min,1 h were statistically significant(P＜0.05).ConclusionCardiomyocytes hypertrophy is associated with Prdx-3 upregulation induced by AngiontensinⅡ.

Peroxiredoxin-3;Reactive oxygen species;Cardiomyocytes hypertrophy;AngiotensinⅡ

R541.6

A

1673-7210（2015）07（a）-0027-03

2015-02-02本文編輯：蘇暢）

河北省留學人員科技活動項目（D2012003028）。▲