P4對雙氧水誘導SH-SY 5Y細胞凋亡的保護作用

金鑫，陰育紅，馬婷

1.黑龍江佳木斯市中心醫(yī)院神經內二科，黑龍江佳木斯 154000；2.黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院神經內一科，黑龍江佳木斯 154000

P4對雙氧水誘導SH-SY 5Y細胞凋亡的保護作用

金鑫1，陰育紅1，馬婷2

1.黑龍江佳木斯市中心醫(yī)院神經內二科，黑龍江佳木斯 154000；2.黑龍江省佳木斯市中心醫(yī)院神經內一科，黑龍江佳木斯 154000

目的研究P4對雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響。方法體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，建立雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的模型，給予P4進行干預。應用Hoechst染色，測定細胞凋亡率。結果10uM的雙氧水24 h可以使SH-SY5Y細胞凋亡率達到（56.33±13.17）%。然而，給予P4后，SH-SY5Y細胞的凋亡率明顯減低,P4加雙氧水組與雙氧水組對比差異有統計學意義（P<0.05）。結論P4對SH-SY5Y細胞的凋亡有保護作用。

P4；雙氧水；SH-SY5Y細胞；Hoechst33258染色

氧化應激長期以來被認為是中樞神經系統退行性疾病(如阿爾茨海默病)神經元損傷的一個主要因素。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷[1-3]。活性氧自由基包括超氧陰離子（·O2-）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H2O2）等。過氧化氫（H2O2），作為主要的活性氧，可以改變細胞的細胞內氧化還原狀態(tài)，誘導氧化損傷其轉化成高反應性的羥基自由基。此外，過氧化氫和羥基自由基導致線粒體的結構和功能的損傷，引起細胞凋亡。因此，過氧化氫已經被廣泛使用在中樞神經系統的神經毒性和神經保護作用的氧化應激細胞培養(yǎng)模型中[4]。SH-SY5Y是一種分化程度較低的腫瘤細胞，顯示中水平的多巴胺-β-羥基酶活性，細胞形態(tài)、生理及生化功能與正常神經細胞相似，并具有明顯的軸突[5]。有研究表明，P4不僅用于生殖系統，而且對中樞神經系統也有保護作用[6]。該實驗主要研究P4對SH-SY5Y細胞的保護作用及機制，為臨床治療中樞神經系統退行性疾病提供實驗數據。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3—10月期間培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞作為實驗樣本，把分化1周的SH-SY5Y細胞分為對照組（什么都不加），雙氧水組（只加10 uM雙氧水），BDNF+雙氧水組，DMSO預處理液+雙氧水組，DMSO預處理液+Y1036+雙氧水組,P4預處理液+雙氧水組，P4預處理液+Y1036+雙氧水組。24 h后除對照組之外，其余都加入10uM雙氧水，放入CO2培養(yǎng)箱中。24h后用Hoechst33258染色，測定細胞凋亡率。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)方法 細胞培養(yǎng)液（250 mL）：DMEM/F12培養(yǎng)基225mL活性炭吸附的小牛血清或小牛血清37.5mL青霉素/鏈霉素2.5mL。

用含有FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)SH-SY5Y細胞24 h。24 h后，用PBS洗2次，用0.5mL胰蛋白酶快速洗1遍，在放入1mL胰蛋白酶，放入CO2培養(yǎng)箱中5Min。然后加入5 mL含有FBS的培養(yǎng)液，將細胞充分混勻后進行數細胞。用含C.S.FBS培養(yǎng)液和維甲酸以5×104/ML的密度將細胞鋪到12孔板中，分化1周。

將DMSO和10 nMP4加入到C6細胞中，處理24 h。然后提取上清液做為預處理溶液。

1.2.2 雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的處理方法 應用Hoechst染色，測定細胞凋亡率。按5×104/mL的密度將細胞鋪到6孔板中。分為3組：正常對照組，不加雙氧水；加入5 uM的雙氧水；加入10 uM的雙氧水。每組2個孔。24 h后，用Hoechst33258染色，測定細胞凋亡率。

1.2.3 P4對SH-SY5Y細胞凋亡的處理方法 把分化1周12孔板的SH-SY5Y細胞分為對照組（什么都不加），雙氧水組（只加10uM雙氧水），BDNF+雙氧水組，DMSO預處理液+雙氧水組，DMSO預處理液+Y1036+雙氧水組,P4預處理液+雙氧水組，P4預處理液+Y1p036+雙氧水組。將加入BDNF，DMSO預處理液，DMSO預處理液+Y1036，P4預處理液，P4預處理液+Y1036的細胞放入CO2培養(yǎng)箱中。24 h后除對照組之外，其余都加入10uM雙氧水，放入CO2培養(yǎng)箱中。24 h后用Hoechst33258染色，測定細胞凋亡率。

1.3 統計方法

該次研究相關數據采用Graphad PrisM5統計學軟件處理，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用F檢驗。

2 結果

2.1 雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡的濃度

正常對照組細胞呈橢圓或梭形，軸突明顯。隨著，雙氧水濃度增高，細胞損傷也隨之加重，胞膜破裂，細胞核固縮、凝聚和碎裂，見圖1。采用5uM的雙氧水處理SH-SY5Y細胞24 h后，凋亡率與正常對照組差異無統計學意義（P=0.6257>0.05）；用10 uM的雙氧水處理SH-SY5Y細胞24 h，凋亡率達到（56.33±13.17）%,與正常對照組差異有統計學意義（CF=5.950,P=0.0377<0.05），見圖2：圖中*符號表示響應的兩組差異有統計學意義。所以，10 uM的雙氧水是誘導SH-SY5Y細胞凋亡的最佳濃度。

圖1 不同濃度雙氧水對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響

2.2 P4對SH-SY5Y細胞的保護作用

用10uM的雙氧水處理SH-SY5Y細胞24h后，經Hoechst33258熒光染色，發(fā)現有亮藍色的典型凋亡細胞。加入P4-CM組凋亡細胞明顯減少，但是P4-CM+Y1036組凋亡的細胞有所增加，雙氧水組與P4-CM組差異有統計學意義（χ2=0.774 5，F=8.01 4,P=0.000 7<0.05，見圖3：*，@，#分別表示具有統計學意義的對照組），雙氧水組與P4+Y1036+雙氧水差異無統計學意義（P=0.082 5>0.05）。所以，P4對雙氧水誘導SH-SY5Y細胞凋亡有保護作用，且是通過增加BDNF釋放來起到保護作用的。

圖2 不同濃度雙氧水對SH-SY5Y細胞凋亡的影響

圖3 不同組合下SH-SY5Y細胞的保護作用的統計分析

3 討論

中樞神經系統退行性疾病一直被認為是頑固而難治的“三不”（病因不明，療效不好，預后不良）性疾病。研究證明，神經細胞死亡的形式有：凋亡，壞死，自身吞噬，細胞質增生。過氧化氫（H2O2）是體內氧化代謝的中間產物，屬于非自由基活性氧，易穿透細胞膜，與細胞內的還原型鐵離子通過Fenton反應生成高度毒性的羥自由基，對多種細胞（特別是腦組織神經元細胞）造成毒性，引起細胞死亡[7-9]。所以，本研究以H2O2作用于體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，造成氧化損傷模型[10]。

本實驗首先應用Hoechst33258熒光染色對H2O2誘導SH-SY5Y細胞的濃度進行檢測，結果表明，10uMH2O2處理細胞24 h后，凋亡率達到（58.33±13.17）%，5 uM的雙氧水處理細胞24 h后，凋亡率與正常對照組無統計學差異。所以選用10 uMH2O2誘導SH-SY5Y細胞凋亡[11-12]。給予H2O2之前，分別加入BDNF，DMSO預處理液，DMSO預處理液+Y1036，P4預處理液，P4預處理液+ Y1036。結果表明加入P4預處理液的細胞比加入DMSO預處理液的細胞，凋亡率明顯減少。加入Y1036組比沒加Y1036組細胞凋亡率有所增加。該實驗證明，P4通過增加BDNF的釋放對H2O2誘導SH-SY5Y細胞凋亡起到保護作用。下一步研究P4對小鼠海馬損傷是否有保護作用，該研究可能有益于中樞神經系統退行性疾病的治療。

[1]韓銘,鄧子輝,薛輝,等.瘦素減輕6-羥基多巴胺誘導的SH-SY5Y細胞損傷[J].解放軍醫(yī)學院學報，2014（1）:70-73，77.

[2]張囡,楊靜嫻,孫東,等.牛蒡苷元對H89誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用[J].藥學進展,2014（3）:215-219.

[3]張琪,李酈蕓,彭順利,等.蘆薈大黃素對MPP~+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用[J].吉林醫(yī)藥學院學報,2014（1）:28-30.

[4]XiAChen,QiZhang,QiongCheng.FeiDing Protective effectofsalidroside againstH2O2-induced cellapoptosisin primary cultureof rathippocampal neurons[J].MolCell Biochem，2009，332（1-2）:85-93DOI10.1007/s11010-009-0177-3

[5]馮波，王蓉，盛樹力.神經退行性疾病研究中擬神經細胞模型:人神經母細胞瘤株SH-SY5Y的來源特性及應用[J].臨床康復,2006,10(6):121-123.

[6]Singh M.Progesterone-induced neuroprotection.Endocrine，29:271-274.

[7]Lin MT,Beal MF.Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases[J].Nature，2006,443(7113):787-795.

[8]Zhang HA,Gao M,Zhang L,et al.Salvianolic acid Aprotects human SH-SY5Y neuroblastomAcellsagainstH2O2-induced injury by increasing stresstoleranceability[J].BiocheMBiophys Res Commun,2012,421(3):479-483.

[9]Rhee SG.H2O2,Anecessary evil for cell signaling[J].Science,2006,312 (5782):1882-1883.

[10]郭春燕，羅強，孫黎，等.芍藥苷對H2O2誘導SH-SY5Y神經細胞損傷的保護作用[J].中草藥，2013，44（20）：2864.

[11]潘劍,李紹平,李建雄,等.羥基紅花黃色素A對MPP~+誘導的SHSY5Y細胞凋亡的保護作用[J].西安交通大學學報:醫(yī)學版,2014（5）: 690-694.

[12]王訓翠，王秀，李慶林.伴侶自吞噬在MPP~+損傷的SH-SY5Y細胞中的影響及葛根素的干預作用[J].中國中藥雜志,2014（1）:106-112.

The Protection of P4 on Hydrogen Peroxide Induced Apoptosis in SH-SY5Y Cells

JIN Xin1,YIN Yu-hong1,MATing2
1.Second Department of Neurology,JiamusiCentral Hospital,Jiamusi,Heilongjiang Province,154002 China；2.First Department of Neurology,Jiamusi Central Hospital,Jiamusi,Heilongjiang Province,154002 China

ObjectiveTo study the effects of P4 on hydrogen peroxide induced apoptosis in SH-SY5Y cells.MethodsModel of hydrogen peroxide induced apoptosis in SH-SY5Y cellswhich were cultured in vitro was built,for the intervention for which,P4 was used.The ratio of apoptosis determined by hoechst staining.ResultsApoptosis rate of SH-SY5Y cell was 56.33%±13.17% under 10uMhydrogen peroxide in 24 hours.However,after giving P4,SH-SY5Y cell apoptosis rate was significantly reduced. Therewere statistically significant differences between P4 plus hydrogen peroxide and hydrogen peroxide group(P<0.05).ConclusionP4 on apoptosis of SH-SY5Y cells have Aprotective effect.

P4;H2O2;SH-SY5Y cells;Hoechst33258 staining

R74

A

1674-0742（2015）06（b）－0045-03

2015-03-10）

金鑫（1979-），女，黑龍江佳木斯人,碩士，主治醫(yī)師，主要從事缺血性腦卒中的神經保護作用機制方面的研究工作。

陰育紅（1971-），女，山東肥城人，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經內科工作。郵箱：xinjin620@163.com。