膠乳增強免疫比濁法定量測定血漿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的方法學評價及臨床應用

孫麗，牛國平

(徐州市中心醫院檢驗科，江蘇徐州221009)

膠乳增強免疫比濁法定量測定血漿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的方法學評價及臨床應用

孫麗，牛國平

(徐州市中心醫院檢驗科，江蘇徐州221009)

目的對膠乳增強免疫比濁法(LEIA)定量測定血漿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)進行方法學評價并探討其初步的臨床應用。方法應用美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)的標準化評價方案評價LEIA測定血漿NGAL的不精密度、回收率、線性范圍、抗干擾性、穩定性等指標。同時測定86例2型糖尿病(T2DM)患者(其中包括41例糖尿病腎病(DN)患者)、40名體檢健康者(正常對照組)的血漿NGAL水平。結果LEIA測定血漿NGAL低、高水平的批內變異系數(CV)分別為3.76%、1.79%;日間CV分別為6.62%、3.45%。平均回收率為97.3%～104.6%;在0～5 000 μg/L內線性良好，線性范圍內偏差＜8%。與進口同類試劑盒(粒子增強免疫比濁法)具有高度相關性(R2=0.996 6)，兩種檢測方法在200和700 μg/L處的偏倚分別為3.66和11.79 μg/L，均滿足廠家規定的要求?？偰懠t素≤600 μg/L、血紅蛋白≤10 g/L、維生素C≤0.6 g/L、甘油三酯≤15 mmol/L時對LEIA測定血漿NGAL均無明顯干擾;試劑在儀器2～8℃的條件下放置，至少可保存穩定35 d;20名健康體檢者血漿NGAL水平均處于廠家聲明的參考區間內。正常對照組、T2DM組和DN組血漿NGAL水平呈逐步增高趨勢，各組間差異均有統計學意義(P均＜0.01)。血漿NGAL與血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cys C)、肌酐(Cr)呈正相關(相關系數分別為0.58、0.43，P均＜0.01)。結論LEIA測定血漿NGAL具有較高的靈敏度和精密度，所測結果準確可靠，能直接在自動生化分析儀上使用，操作簡便、快速，適用于大批量測定。

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白;膠乳增強免疫比濁法;方法學評價

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)，也稱為脂質運載蛋白-2(lipocalin-2)，是脂質運載蛋白家族成員之一，于1993年由KJELDSEN等[1]在研究人類中性粒細胞92000明膠酶B[即基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)]時首先發現，存在于培養的活化中性粒細胞上清液中。近年來研究發現，血漿NGAL能迅速、靈敏、特異地反映各種腎臟疾病的損傷及恢復過程，成為檢測腎損傷新的生物學指標[2-10]。同時NGAL在心腦血管疾病、糖尿病等領域的研究也逐漸展開，其在臨床上具有廣闊的應用前景。膠乳增強免疫比濁法(latex-enhanced immunoturbidimetric assay，LEIA)是近年來開展起來的一種高靈敏度、高特異性的免疫檢測方法，可直接在全自動生化分析儀上進行批量測定，因此在臨床上已得到廣泛應用。我們應用美國臨床實驗室標準化協會(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的標準化評價方案對LEIA測定血漿NGAL進行方法學評價，并探討該方法的臨床應用價值。

材料和方法

一、對象

按1999年世界衛生組織的糖尿病診斷和分型標準[11]，選擇2014年1月至2014年7月在徐州市中心醫院治療的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者86例，其中男47名、女39名，年齡41～63歲;選取2014年1月至2014年7月徐州市中心醫院體檢中心健康體檢者40名作為正常對照組，其中男22名、女18名，年齡37～55歲，無腎小球腎炎、糖尿病、良性腎動脈硬化、系統性疾病腎臟損害等。所有研究對象均無嚴重心功能不全、冠心病、肝病、膠原疾病、腦梗死及肺部疾病。

二、儀器與試劑

日立7600-020型全自動生化分析儀(日本日立公司)。NGAL檢測試劑盒1(LEIA，批號: 20130612)、校準品(批號:20130711)、質控物(批號:20130612)均由上?？迫A生物技術有限公司提供。NGAL檢測試劑盒2(粒子增強免疫比濁法，批號:062051)、校準品(批號:062041)、質控物(批號:062041-01)均采用丹麥BioPorto Diagnostics A/S公司提供。兩種試劑盒檢測原理與分析參數基本相同。

三、檢測原理

待測樣本中NGAL與試劑中包被于聚苯乙烯粒子上的NAGL抗體結合，形成不溶性免疫復合物，該免疫復合物由于包被的聚苯乙烯粒子而使濁度進一步放大，在NGAL抗體足量的情況下，其濁度與樣本中NGAL含量成一定比例關系，與相同條件下操作的標準品比較，通過劑量/反應曲線求出樣本中NGAL的含量。

四、主要分析參數

樣本體積為3.0 μL，試劑1(R1)為150 μL，試劑2(R2)為50 μL;采用兩點終點法:反應方向為向上反應，主波長570 nm，副波長800 nm，反應溫度為37℃，第19個讀光點讀取吸光度值1 (A1)，第34讀光點讀取吸光度值2(A2)，待測標本A=A2-A1。

五、方法學評價

1.精密度參考CLSI EP5-A2文件，分別測定低值(206 μg/L)和高值(707 μg/L)NGAL。2 h內兩水平連續測定20次，計算均值()、標準差(s)、批內變異系數(CV);然后兩水平每天測定1次，連續測定20 d，計算、s、日間CV。

2.回收實驗參考CLSI EP15-A文件，制備1份新鮮的患者混合血漿作為基線標本，重復測定5次求平均值，向每一份1.8 mL的混合基線標本中分別加入0、50、100、150、200 μL NGAL高值校準品(600 μg/L)，再分別加入200、150、100、50、0 μL生理鹽水。將上述5份體積均為2.0 mL的標本用LEIA進行3次重復檢測并計算平均值。通過測定值減去各自基線值確定回收量，回收率(%)=回收量/加入量×100。

3.線性實驗參考CLSI EP6-A文件，以蒸餾水為1號標本，以高值(5 000 μg/L)校準品為6號標本，將1號標本和6號標本按5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5的比例進行混合，分別對6個標本重復測定3次，取平均值為測得濃度(Y)，對設定的理論濃度(X)與實際測得濃度采用多次回歸方案進行線性評價，并獲得其回歸方程及相關系數(r)。

4.相關性分析按CLSI EP9-A2文件要求做方法學對比實驗。選擇64份包括高、中、低濃度的臨床樣本，每天測定8份樣本，分別用粒子增強免疫比濁法(進口試劑)和LEIA按1→8測定，第2次按8→1重復測定，連續測定8 d。將兩種檢測系統測得的結果進行相關性分析，若顯著相關，計算其回歸方程及兩種檢測方法間的偏倚。

5.抗干擾試驗參考CLSI EP7-A2文件，收集外觀正常且無溶血、黃疸、脂血的新鮮混合血漿標本，分別加入一定量的膽紅素(濃度分別為200、300、400、500、600 mg/L)、血紅蛋白(濃度分別為2、4、6、8、10、12g/L)、甘油三酯(triglyceride，TG)，濃度分別為1、2.5、5、10、15、20 mmol/L)和維生素C(濃度分別為200、300、400、500、600 mg/L)，干擾物質與混合血漿的體積之比為1∶9，另1份加入等體積的生理鹽水作為對照。每份標本重復測定3次，計算各自的平均干擾值，以相對偏差＜10%作為該檢測方法對干擾物的判斷限[12]。在范圍內判斷為無明顯干擾，否則為有明顯干擾。

6.試劑開瓶穩定性將試劑在2～8℃條件下，在儀器上開蓋放置40 d，第0天(即當天)校準后不再校準，分別在第0、5、10、15、20、25、30、35、40天測定相同兩份(低值、高值)血清樣本，重復3次，計算及相對偏差。以相對偏差＜10%作為該試劑穩定性的判斷限。

7.參考區間驗證選擇徐州市中心醫院體檢中心健康體檢者20名(男、女各10名，年齡19～70歲)作為參考個體，無糖尿病、腎小球腎炎、良性腎動脈硬化、系統性疾病腎臟損傷等能引起血漿NGAL水平升高的疾病。采集空腹靜脈血3 mL，置于EDTA-Na2抗凝管中離心后分離血漿，測定NGAL水平。測定結果采用Dixon法進行離群值檢驗。若出現離群值要剔除，用新的參考個體代替，補足20名。觀察20名參考個體的檢測值在廠家聲明的參考區間之外是否超過2例。

8.臨床試驗將86例T2DM患者根據尿微量白蛋白/尿肌酐比值(albumin to creatinine ratio，ACR)分組。(1)正常白蛋白尿組(NA):45例，男25例、女20例，年齡42～63歲，ACR＜30 mg/mmoL; (2)高白蛋白尿組(含大量和微量白蛋白尿患者，即CN+MA組):41例，男22例、女19例，年齡41～59歲，ACR≥30 mg/mmoL。采用LEIA測定86例T2DM患者及40名體檢健康者(正常對照組)血漿NGAL和血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C (cystatin C，Cys C)，同時分別采用膽固醇氧化酶法、甘油磷酸氧化酶法、清除法、紫外-谷氨酸脫氫酶法、肌氨酸氧化酶法、氧化酶法、己糖激酶法和速率法檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、TG、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-C)、尿素(urea)、肌酐(creatinine，Cr)、尿酸(uric acid，UA)、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)并做相關性分析。

六、統計學方法

結果

一、精密度評價

LEIA測定NGAL低、高值的批內CV分別為3.76%、1.78%，日間CV分別為6.62%、3.45%，均低于試劑廠家聲明的不精密度，見表1。

表1 LEIA的批內與日間精密度

二、回收率

作為基線標本的新鮮混合血漿的平均值為180 μg/L，NGAL高值校準品為600 μg/L，計算平均回收率為99.7%，符合實驗要求。見表2。

表2 回收試驗結果

三、線性范圍

采用多項式回歸對結果進行處理，結果顯示3種回歸處理的一次系數b1差異均具有統計學意義(P＜0.05)，二次回歸系數和三次回歸多項式的二、三次系數均無統計學意義(P＞0.05)，因此該實驗結果是線性的。以理論值為橫坐標(X)、實測值為縱坐標(Y)進行直線回歸分析。結果顯示LEIA測定血漿NGAL在0～5 000 μg/L范圍內線性良好，相關方程為Y=1.059X-41.143，R2=0.995 7。見圖1。

圖1 LEIA測定血漿NGAL的線性實驗

四、相關性分析

用粒子增強免疫比濁法(進口試劑)和LEIA平行測定64例樣本，以測定結果為X軸、LEIA測定結果為Y軸、進行相關性分析。結果顯示兩種檢測方法呈高度正相關，直線回歸方程為Y= 0.969X-9.836，R2=0.996 6，P＜0.01。見圖2。利用回歸方程中的斜率和截距計算得NGAL在 200和700 μg/L處兩種檢測方法間的偏移分別為3.66和11.79 μg/L，遠低于廠家規定的允許偏倚(7.5%)。

五、抗干擾性

總膽紅素≤600 mg/L、TG≤15 mmol/L、血紅蛋白≤10 g/L，維生素C≤600 mg/L時對NGAL的測定無明顯干擾，符合廠商聲明。

六、試劑開瓶穩定性

在第35天測定低值的相對偏差為9.38%，高值的最大偏差為6.01%，均在試劑廠家聲明誤差范圍內，見表3。試劑開瓶后可穩定35 d，穩定性良好。

圖2 兩種檢測方法測定血漿NGAL結果的相關性

表3 試劑開瓶穩定性試驗

七、參考區間驗證

20名健康體檢者的血漿NGAL測定結果在52～319 μg/L之間，為99.4 μg/L，均處于廠家聲明的參考區間(＜400 μg/L)內。

八、臨床試驗

CN+MA組、NA組及正常對照組年齡及男、女比例差異均無統計學意義(P＞0.05)，其他項目測定結果見表4。正常對照組、T2DM組和DN組血漿NGAL水平分別為101.40±7.70、 158.10±13.24和(237.80±30.60)μg/L，呈逐步增高趨勢，各組間差異均有統計學意義(P均＜0.01)，見圖3。血漿NGAL與血清Cys C、Cr呈正相關(r值分別為0.58、0.43，P均＜0.01)，見圖4、圖5。

表4 CN+MA組、NA組及正常對照組一般資料比較

圖3 各組患者血漿NGAL水平比較

圖4 血漿NGAL與血清CysC的相關性分析

圖5 血漿NGAL與血清Cr的相關性分析

討論

NGAL蛋白由一條肽鏈構成，肽鏈由C端的α螺旋，N端的310螺旋和中間的8段反平行式β折疊構成的β折疊桶組成，具有典型的β2折疊桶狀結構，其相對分子質量為25 000[13]。正常人體中NGAL的表達在不同組織細胞中差異較大。生理狀態下成熟的中性粒細胞不能合成NGAL，但炎癥因子的刺激可以促進其儲存在細胞內特殊顆粒的NGAL蛋白的分泌。研究發現，在腎臟發生缺血的極早期(≤2 h)，NGAL在血、尿中的含量即明顯升高。因此，NGAL可作為急性腎臟病變的早期標志物[2-10]。FASSETT等[14]分析88例慢性腎臟病患者時發現，血漿NGAL含量與慢性腎病發病明顯相關，可作為疾病診斷指標。所以NGAL不但是急性腎臟疾病早期的標志物，同時與慢性腎臟疾病也明顯相關。

目前NGAL的測定方法主要有免疫印跡法、放射免疫法、酶聯免疫法及化學發光法。免疫印跡法操作復雜，測定精密度低;放射免疫法存在著環境污染問題;酶聯免疫法受人為因素影響較大、自動化程度不高，難以滿足臨床大批量標本的檢測;而化學發光法靈敏度雖高，但測定線性范圍較小且檢測成本較高，需要特定儀器。這些原因導致NGAL的應用范圍較小，難以在臨床上普及應用。本研究采用LEIA測定血漿NGAL水平，該方法簡便、快速、靈敏、可靠，對儀器設備要求不高，可以在全自動生化儀上應用。方法學性能評價結果表明，LEIA測定血漿NGAL低、高水平的批內CV分別為3.75%、1.79%，日間CV分別為6.63%、3.45%，均符合廠商對不精密度的要求;平均回收率為97.3%～102.6%;在0～5 000 μg/L處線性良好，線性范圍內偏差＜8%。與進口同類試劑盒具有高度相關性(R2= 0.996 6)，偏倚均在廠家推薦的范圍內;血紅蛋白≤10 g/L、總膽紅素≤600 mg/L、維生素C≤0.6 g/L、TG≤15 mmol/L無明顯干擾;在儀器2～8℃條件下放置至少可用35 d。DN組血漿NGAL水平明顯高于T2DM組和正常對照組(P＜0.01)，且與血清Cys C、Cr呈正相關(r值分別為0.58、0.43，P均＜0.01)。因此血漿NGAL水平與腎損傷的嚴重程度相一致，是出現于DN早期的生物學指標[10，15]，可以作為DN早期無創性的診斷指標。

綜上所述，LEIA檢測血漿NAGL操作簡便、快速，可在十幾分鐘內即可得出結果，適宜在全自動生化分析儀上批量操作使用，不需要特殊的儀器設備。該方法具有良好的精密度和正確度，相關性好，線性范圍寬，抗干擾能力強，具有重要的臨床應用價值，適合在臨床上廣泛開展。

[1]KJELDSEN L，JOHESEN AH，SENGEL?V H，et al.Isolation and primary structure of NGAL，a novel protein associated with human neutrophil gelatinase[J].J Biol Chem，1993，268(14):10425-10432.

[2]須靜，胡曉波.中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白的研究進展[J].檢驗醫學，2012，27(10): 871-876.

[3]張群妹，郭慶合，魯廣建，等.尿NGAL和血清Cys C在百草枯中毒患者急性早期腎損傷中的變化及意義[J].檢驗醫學，2012，27(11):940-943.

[4]鄔葉紅，趙榮平，徐燕萍.尿中性粒細胞明膠酶相關性脂質運載蛋白檢測對SLE腎病的臨床意義[J].檢驗醫學，2012，27(3):189-191.

[5]蔡雷鳴，厲倩，金才峰，等.血清中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白檢測在急性腎功能損傷早期診斷中的臨床意義[J].檢驗醫學，2012，27(4): 287-290.

[6]胡雷光，朱立岳，謝芳，等.尿NGAL在順鉑化療腫瘤患者腎小管損傷中的臨床意義探討[J].檢驗醫學，2013，28(5):374-378.

[7]徐磊，徐曉萍，應春妹.NGAL在成人心臟術后急性腎損傷中的早期應用價值探討[J].檢驗醫學，2014，29(2):139-142.

[8]張雅麗，崔麗艷，張捷.中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白在急性腎損傷中的保護作用[J].檢驗醫學，2015，30(1):80-84.

[9]張科，劉彧崟，張春，等.尿NGAL與CKD腎小管間質損傷的相關性研究[J].檢驗醫學，2015，30 (4):327-330.

[10]蔡雷鳴，厲倩，譚龍益.尿中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白在糖尿病腎病早期診斷中的作用[J].檢驗醫學，2015，30(6):588-590.

[11]ALBERTI KG，ZIMMET PZ.Definition，diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications.Part 1:diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation[J].Diabet Med，1998，15(7):539-553.

[12]徐國賓，蔣琳.臨床生物化學常規定量方法的分析性能評價[J].中華檢驗醫學雜志，2007，30(6): 718-720.

[13]KJELDSEN L，BAINTON DF，SENGEL?V H，et al.Identification of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel matrix protein of specific granules in human neutrophils[J].Blood，1994，83(3):799-807.

[14]FASSETT RG，ROBERTSON IK，BALL MJ，et al.Effects of atorvastatin on NGAL and cystatin C in chronic kidney disease:a post hoc analysis of the LORD trial[J].Nephrol Dial Transplant，2012，27 (1):182-189.

[15]曾健英，童俊容，何鳳，等.中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白對糖尿病腎病早期診斷的意義[J].中國糖尿病雜志，2011，19(1):27-30.

Evaluation and clinical application of latex-enhanced immunoturbidimetric assay for the detection of plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin

SUN Li，NIU Guoping.(Department of Clinical Laboratory，Xuzhou Central Hospital，Jiangsu Xuzhou 221009，China)

ObjectiveTo evaluate latex-enhanced immunoturbidimetric assay(LEIA)for the detection of plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)and its clinical application.MethodsLEIA was used to determine the concentration of plasma NGAL according to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)standardization evaluation protocal.The imprecision，recovery rate，linear range，anti-interference and stability were assessed.The plasma NGAL levels of 86 patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM)，including 41 patients with diabetic nephropathy(DN)，and 40 healthy subjects(healthy control group)were determined.ResultsThe within-run coefficients of variation(CV)for low and high levels of NGAL were 3.76%and 1.79%，respectively.The inter-day CV were 6.62%and 3.45%，respectively.The average recovery rate was 97.3%-104.6%.The linear range was from 0 to 5 000μg/L，and the deviation was＜8%.Comparing with similar foreign kit(particle-enhanced immunoturbidimetric assay)，the correlation was high(R2=0.996 6).The system biases of 200 μg/L and 700 μg/L were 3.66 μg/L and 11.79 μg/L，respectively.The results met the requirements of manufacturers.There was no significant interference on the determination of plasma NGAL with total bilirubin≤600 μmol/L，hemoglobin≤10 g/L，vitamin C≤0.6 g/L and triglyceride≤15 mmol/L.The reagent could be stable for 35 d in the instrument under the condition of 2-8℃.The plasma levels of NGAL in healthy control group were all in manufacturers'reference range.The level of plasma NGALhad been gradually increasing in healthy control group，T2DM group and DN group with statistical significance(P＜0.01).The plasma NGAL were positively correlated with serum cystatin C(Cys C)and creatinine(Cr)(correlation coefficients were 0.58 and 0.43，P＜0.01).ConclusionsThe LEIA for plasma NGAL determination has high sensitivity and precision，which is fast and easy to operate，and can be used directly on the automatic biochemical analyzer.The results are accurate and reliable.It is suitable for the clinical application for mass determination.

Neutrophil gelatinase-associated lipocalin;Latex-enhanced immunoturbidimetric assay;Methodology evaluation

1673-8640(2015)07-0734-06

R

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.07.016

2014-10-08)

(本文編輯:龔曉霖)

徐州市科技局資助項目(XZZD1348)

孫麗，女，1974年生，學士，副主任技師，主要從事臨床生化檢驗工作。

牛國平，聯系電話:0516-83956513。