益氣活血藥對心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43表達及室顫發生的影響

吳愛明，婁利霞，張冬梅，柴立民，聶 波，趙明鏡

·基礎醫學論著/研究·

益氣活血藥對心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43表達及室顫發生的影響

吳愛明，婁利霞，張冬梅，柴立民，聶 波，趙明鏡

目的 探討益氣活血藥(生脈注射液聯合血塞通注射液)對心肌梗死大鼠心室縫隙連接蛋白43(Cx43)表達及室顫發生的影響。方法 采用結扎心臟左冠狀動脈前降支的方法建立心肌梗死大鼠模型，另設假手術(只穿線，不結扎)作對照。術后隨機分為模型組、假手術組、卡托普利組和益氣活血組。卡托普利組給予卡托普利片4.39 mg/(kg·d)溶解灌胃；益氣活血組給予生脈注射液3.51 mL/(kg·d)，血塞通注射液17.54 mg/(kg·d)腹腔注射；模型組和假手術組給予生理鹽水，療程4周。治療結束后取材，采用real time PCR法檢測左心室梗死邊緣區Cx43 mRNA的表達；Western blot法檢測Cx43蛋白表達；在體電刺激記錄室顫誘發率。結果 與假手術組比較，模型組Cx43的mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組和益氣活血組Cx43的mRNA和蛋白表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。在體電刺激室顫誘發率模型組最高，卡托普利組和益氣活血組的室顫誘發率降低，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 生脈注射液聯合血塞通注射液可以減少心肌梗死后室顫的發生，其機制與改善心室Cx43表達有關。

心肌梗死；心室顫動；縫隙連接蛋白43；益氣活血

縫隙連接蛋白43(Cx43)是心室表達最豐富的縫隙連接蛋白。Cx43所構成的縫隙連接為心肌細胞間電信號的傳導提供了直接通道，對維持心律協調同步具有非常重要的意義。心肌梗死后Cx43遭受破壞，導致心電傳導異常，為室性心律失常的形成提供了基本條件[1]。益氣活血法是中醫治療心律失常的基本治法。本研究在其指導下，采用生脈注射液聯合血塞通注射液對心肌梗死大鼠進行實驗性干預，觀察其對心室Cx43基因和蛋白表達以及室顫發生的影響，為闡明益氣活血藥治療心肌梗死后心律失常的療效和機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠，體重200 g～240 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 主要儀器 ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)、BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)、Mx3000P實時熒光定量PCR儀(美國安捷倫 Stratagene公司)、Bio-Rad穩壓穩流電泳儀、垂直電泳槽和轉膜儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 主要試劑 Oligo(dT)15Primer，dNTP Mix，M-MLV Reverse Transcriptase均為Promega公司產品。SYBR Green PCR Master Mix為ABI公司產品。Cx43多克隆抗體(貨號：sc-6560-R)為Santa cruz公司產品。

1.4 模型制備方法 大鼠經1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，經喉氣管插管，機械通氣，左胸前區備皮消毒，于第三、四肋間隙逐層開胸，暴露心臟，結扎左冠狀動脈前降支(假手術只穿線，不結扎)，然后將心臟復位，逐層縫合。心電圖ST段顯著抬高為結扎成功。術后給予青霉素抗感染。

1.5 分組給藥方法 大鼠術后隨機分為模型組、假手術組、卡托普利組和益氣活血組。參照徐淑云《藥理實驗方法學》中的等效劑量換算公式計算大鼠藥量，具體藥量如下：卡托普利組給予卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司)4.39 mg/(kg·d)充分溶解灌胃；益氣活血組給予生脈注射液(雅安三九藥業有限公司)3.51 mL/(kg·d)、血塞通注射液(昆明制藥集團股份有限公司)17.54 mg/(kg·d)腹腔注射；模型組和假手術組給予生理鹽水。療程為4周。

1.6 在體電刺激誘發室顫方法 治療結束后，大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，經喉氣管插管，機械通氣，開胸暴露心臟，連接BL-420F生物機能實驗系統，記錄Ⅱ導聯心電圖，同時將刺激電極正極置于心尖部，負極置于正極右側約3 mm處的左室前壁非梗死區，以程控電刺激參數：每串10個刺激波，脈寬5 ms，刺激電壓1 V遞增，記錄各組大鼠在9 V刺激電壓時的室顫發生率。

1.7 心肌組織Cx43 mRNA檢測方法 采用real time PCR法，用Primer Premier 5軟件進行引物設計。Cx43，120bp forward：5′-TTCATGCTGGTGGTGTCC-3′；reverse：5′-AGTGGTGGCGTGGTAAGG-3′。GAPDH，95bp forward：5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGA-3′；reverse：5′-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3′。擴增條件為：95 ℃ 10 min預變性，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40次循環。Cx43 mRNA的相對表達量按照2(-ΔΔct) 法計算。

1.8 心肌組織Cx43蛋白檢測方法 采用Western blot法，心肌組織加入適量液氮研磨破碎，在冰浴下裂解，離心提取總蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉后依次與相應特異性一抗和二抗孵育，用化學發光法獲取條帶，掃描膠片后用IPP6.0軟件進行條帶灰度分析，計算目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 Cx43 mRNA表達檢測結果 與假手術組比較，模型組左心室梗死邊緣區Cx43 mRNA的表達下調(P<0.05)，卡托普利組和益氣活血組的表達上調(P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組和益氣活血組的Cx43 mRNA表達上調(P<0.01)。詳見圖1。

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；n= 5。

圖1 各組大鼠左心室梗死邊緣區Cx43 mRNA表達的比較

2.2 Cx43 蛋白表達檢測結果 與假手術組比較，模型組左心室梗死邊緣區Cx43蛋白表達顯著下調(P<0.01)。與模型組比較，卡托普利組和益氣活血組的蛋白表達顯著上調(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2。

注：與假手術組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，

##P<0.01；n= 3。

圖2 各組大鼠左心室梗死邊緣區Cx43 蛋白表達的比較

2.3 電刺激室顫誘發率結果 在體電刺激實驗，在9 V刺激電壓下，不同組間的室顫誘發率不同，經卡方檢驗，差異有統計學意義(P<0.05)。其中模型組室顫誘發率最高，卡托普利組有所降低，益氣活血組的室顫誘發率明顯降低，與假手術組相近。詳見圖3。

注：經卡方檢驗，χ2=8.504，P=0.037。圖中數字為動物數。

圖3 各組大鼠在體電刺激室顫誘發率的比較

3 討 論

據世界衛生組織2013年7月公布的調查結果，冠心病是全球范圍的頭號殺手，每年約有700萬人死于冠心病，其中冠心病心肌梗死患者的死亡風險居高不下，患者多因并發惡性心律失常而猝死。因此，對心肌梗死后心律失常的干預研究具有重要的現實意義。

心肌細胞間的電偶聯障礙是導致心律失常的重要誘因，其致心律失常作用不亞于興奮性異常和膜離子通道功能的紊亂。縫隙連接是維持心臟正常電偶聯的關鍵結構。Cx43在心室中表達最豐富，Cx43的損傷和重構與室性心律失常的發生關系密切。研究發現，Cx43基因敲除小鼠在成長到2月齡時，會全部死于自發性室性心律失常[2]。Cx43基因部分敲除小鼠的心肌Cx43表達較正常水平下降了50%，通過結扎左冠狀動脈前降支誘導急性心肌缺血時，與野生型小鼠相比較，Cx43基因部分敲除小鼠的自發性室性心動過速發生率增加了2倍，并且在運動實驗中首次自發性室性心動過速出現的更早，發生頻率更高，同時室性心律失常的持續時間也更長，證明了Cx43表達的降低是心肌梗死后室性心律失常發生的直接誘因[3]。由此提示，保護Cx43是抑制心律失常從而降低心肌梗死患者猝死風險的潛在干預靶點。

中醫藥治療心律失常有著悠久的歷史和獨到的見解。早在《內經》中就有“心澹澹大動、心怵惕”的描述。心律失常屬中醫學“心悸、怔忡”等范疇，為本虛標實、虛實夾雜之證，其證型常復雜多變，但引起心律失常的必要環節均是“心脈瘀阻”，形成“心脈瘀阻”的基本因素是“心臟虧虛”，即“心臟虧虛”和“心脈瘀阻”是各類心律失常的共同病機[4]。因此，益氣活血法是本病的基本治法。一些具有益氣和活血作用的中藥可以抑制心律失常的發生，生脈注射液由紅參、麥冬、五味子組成，功效益氣養陰，復脈固脫，可用于心肌梗死后心悸癥狀的改善。研究證實，生脈注射液對缺血性心律失常[5]和再灌注損傷所致的心律失常[6]具有較好的治療作用，可以降低心內膜單項動作電位復極時間，增強心臟的電穩定性[7]。血塞通注射液的主要成分是三七總皂苷，功效活血祛瘀，通脈活絡，具有良好的抗心肌缺血作用。研究表明血塞通注射液可有效對抗家兔心肌缺血再灌注性心律失常[8]。

本研究在益氣活血法指導下，采用生脈注射液聯合血塞通注射液對心肌梗死大鼠進行實驗性干預，觀察其對心室Cx43基因和蛋白表達以及室顫發生的影響。結果顯示，心肌梗死大鼠左心室梗死邊緣區Cx43 mRNA和蛋白表達均顯著降低，導致心肌細胞間不能形成有效的縫隙連接通道，使心電沖動傳導異常，易于誘發心律失常。此時模型組大鼠在電刺激誘發室顫的實驗中，室顫的誘發率最高。生脈注射液聯合血塞通注射液治療組、卡托普利治療組大鼠的Cx43 mRNA和蛋白表達較模型組明顯上調，改善了縫隙連接通道介導的心電傳導，使室顫的誘發率明顯降低。提示生脈注射液和血塞通注射液聯合應用具有抑制心肌梗死后室顫發生的作用，其機制與改善左心室Cx43的表達有關。

[1] Fana XZ，Zhu HJ，Wu X，et al.Effects of doxycycline on cx43 distribution and cardiac arrhythmia susceptibility of rats after myocardial infarction[J].Iran J Pharm Res，2014，13(2)：613-621.

[2] Gutstein DE，Morley GE，Tamaddon H，et al.Conduction slowing and sudden arrhythmic death in mice with cardiac-restricted inactivation of connexin43[J].Circ Res，2001，88(3)：333-339.

[3] Lerner DL，Yamada KA，Schuessler RB，et al.Accelerated onset and increased incidence of ventricular arrhythmias induced by ischemia in Cx43-deficient mice[J].Circulation，2000，101(5)：547-552.

[4] 魏執真.心律失常中醫診治[M].北京：中國協和醫科大學出版社，1998：10-27.

[5] 古天明，肖業偉，王西霞，等.生脈注射液抗家兔缺血性心律失常的作用[J].華西藥學雜志，2009，24(1)：42-44.

[6] 席孟杰.生脈注射液防治再灌注損傷所致心律失常[J].醫藥論壇雜志，2003，24(14)：18-19.

[7] 邱燕祥.生脈注射液對缺血性心律失常兔心內膜MAP的影響[J].吉林醫學，2012，33(9)：1861.

[8] 王大偉，李俊，莫成榮.中藥注射液抗家兔心肌缺血再灌注性心律失常的實驗研究[J].安徽中醫學院學報，2007，26(3)：37-39.

(本文編輯 郭懷印)

The Influence of Yiqi Huoxue Drugs on the Expression of Connexin 43 and Ventricular Fibrillation in Rats with Myocardial Infarction

Wu Aiming，Lou Lixia，Zhang Dongmei，Chai Limin，Nie Bo，Zhao Mingjing

Zhao Mingjing

Objective To study the effects of Yiqi Huoxue drugs(YQHX，combine Shengmai injection with Xuesaitong injection) on the expression of connexin 43(Cx43)and ventricular fibrillation in rats with myocardial infarction.Methods Model rats of myocardial infarction were established by occlusion of the left anterior descending coronary artery，the sham operation group was without occlusion.After operation rats were randomly divided into sham operation group，model group，YQHX group and captopril group.YQHX[Shengmai injection 3.51 mL/(kg·d)and Xuesaitong injection 17.54 mg/(kg·d)] were administered intraperitoneally.Captopril[4.39 mg/(kg·d)] and distilled water (for the sham operation and model groups) were administered orally.The course of treatment was 4 weeks.The expressions of Cx43 mRNA of myocardium in left ventricular infarct border zone were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction after treatment.The expression of Cx43 protein was observed by western blot.The incidence of ventricular fibrillation was recorded by electric stimulation in vivo.Results Compared with sham operation group，the expressions of Cx43 mRNA and protein decreased remarkably in the model group (P<0.05 orP<0.01).Compared with model group，the expressions of Cx43 mRNA and protein increased significantly in YQHX group and captopril group (P<0.05 orP<0.01).The incidence of ventricular fibrillation was the highest in model group.The incidence of ventricular fibrillation reduced significantly in captopril group and YQHX group(P<0.05).Conclusion Shengmai injection and Xuesaitong injection can reduce the occurrence of ventricular fibrillation after myocardial infarction.It is related to improving the expressions of Cx43.

myocardial infarction；ventricular fibrillation；connexin 43；Yiqi Huoxue drugs

國家自然科學基金資助項目(No.81202685)；北京市教委科研基地項目(No.2012)

北京中醫藥大學東直門醫院中醫內科學教育部和北京市重點實驗室

趙明鏡，E-mail：mjgx2004@163.com

R541.7 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．16．008

1672-1349(2015)16-1837-03

2015-04-11)