金櫻子鞣質提取率影響因素分析及提取條件優化

晏建新 王曉麗

1.貴州省人民醫院藥劑科，貴州貴陽550001；2.貴陽醫學院藥學院，貴州貴陽550004

金櫻子鞣質提取率影響因素分析及提取條件優化

晏建新1，2王曉麗2▲

1.貴州省人民醫院藥劑科，貴州貴陽550001；2.貴陽醫學院藥學院，貴州貴陽550004

目的優化金櫻子中鞣質的超聲提取工藝。方法采用磷鉬鎢酸-紫外分光光度法測定鞣質含量，在單因素試驗的基礎上，選取液料比、超聲提取時間和乙醇百分濃度作為自變量，金櫻子鞣質提取率為因變量，對自變量各水平進行多元線性回歸和二項式擬合，采用星點設計-響應面法選擇最佳工藝條件，并進行預測分析。結果最佳工藝為：乙醇濃度75%，料液比1∶30，超聲提取時間60 min，提取溫度為50℃。結論優化的金櫻子中鞣質超聲波提取工藝簡便可靠、穩定、提取率高，為金櫻子中鞣質的開發利用奠定基礎。

金櫻子；鞣質；超聲提取；響應面法

金櫻子是薔薇科植物金櫻子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果實［1］，又名蜂糖罐，在我國大多數地方均有分布，特別是貴州省分布廣，產量高［2］。金櫻子藥食同源［3］，具有補腎固精、止瀉之功效。化學成分研究多為多糖類和黃酮類，對鞣質類研究較少。鞣質具有收斂性，內服可治胃腸道出血、水瀉等癥，被認為是良好的天然抗氧化劑［4］。鞣質是一類次生代謝產物，植物界廣泛存在，近幾年的研究表明鞣質具有較好的抗腫瘤活性［5］。

星點設計是在二水平析因設計的基礎上，加中心點和星點組成，實驗次數較少，對非線性擬合的實驗設計較適宜，具有實驗設計簡單、試驗次數少、精密度高的特點［6］。響應面法集數學和統計學方法于一體，是建模和多元變量最優化的一種統計方法［7］。對于中藥有效成分的提取工藝研究，星點設計以及效應面優化法是重要的實驗條件設計、優化方法之一，具有數據量大、預測性好、直觀的優點，比正交和均勻設計更適用于探索性的試驗研究。因此采用此方法研究金櫻子中鞣質的超聲提取工藝，為金櫻子的合理開發利用提供一定的科學依據。

1 儀器與試藥

超聲清洗儀（上海超聲設備有限公司，SK3300H型）；紫外分光光度計（津島UV-2401型，日本）；分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；HH-2恒溫數顯水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；FZ102型粉碎機（天津市泰斯特儀器公司）。

沒食子酸（中國藥品生物制品檢定所，批號為：110831-200302），其他所有試劑均為分析純；水為重蒸水。按《中國藥典》2010年版制訂的方法配制磷鉬鎢酸試液。

金櫻子，2013年10月采自貴州遵義縣團溪鎮，經貴陽醫學院藥學院王曉麗教授鑒定為薔薇科植物金櫻子的成熟果實。

2 方法與結果

2.1 鞣質的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對照品25 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取10 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得0.05 mg/mL沒食子酸溶液。

2.1.2 標準曲線的制備精密量取對照品沒食子酸溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL棕色量瓶中，分別加磷鉬鎢酸溶液1 mL，再分別加水11.5、11、9、8、7 mL，搖勻，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度［8］，搖勻，放置30 min，以相應的試劑作空白實驗，照紫外-可見分光光度法，在波長為760 nm處測定，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。其線性方程為Y=0.0609X-0.0056（r=0.9997），表明沒食子酸在0.001～0.011 mg/mL與吸光度呈良好線性關系。

2.1.3 供試品溶液的制備金櫻子去刺、去核毛，置60℃恒溫箱中烘干，自然冷卻后粉碎（過60目篩），精密稱取粉末1 g，置250 mL棕色量瓶中，按照實驗設計，分別精密加入不同百分濃度、不同體積的乙醇，密塞，稱定其質量；超聲波處理不同時間（超聲功率100 W，控制水溫在50℃以下［9-10］）后，取出稱其質量，用相應濃度乙醇補足失掉的質量，搖勻，靜置后濾過，精密量取續濾液5 mL，在25℃條件下，減壓回收至不含乙醇為止，轉移至25 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置后過濾，續濾液即供試品溶液［11］。

2.2 樣品測定

鞣質含量測定［12］按照《中國藥典》2010年版一部附錄XB進行［1］。

2.2.1 總多酚含量的測定精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，按“2.1.2”項下“然后用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度”起，測定其吸光度，利用線性方程計算供試品溶液總多酚含量。

2.2.2 不被吸附的多酚含量的測定精密稱取干酪素0.6 g于100 mL具塞錐形瓶中，精密量取供試品溶液25 mL加入錐形瓶中，密塞，置于30℃的水浴中保溫1 h，期間時時搖動，取出放冷，搖勻，過濾取續濾液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按“2.1.2”項下下“然后用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度”起測定吸光度；同時空白實驗，不被吸附多酚的吸光度=供試品溶液中多酚的吸光度-空白溶液的吸光度，利用線性方程計算供試品溶液不被吸附的多酚含量。

2.2.3 鞣質含量的計算鞣質的含量=總多酚含量-不被吸附多酚含量，鞣質是可被干酪素吸附的多酚；鞣質提取率（%）=提取出的鞣質含量/藥材中鞣質的含量×100%。

2.3 單因素試驗考察

2.3.1 乙醇百分濃度稱取干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇30 mL于100 mL容量瓶中，超聲時間為60 min后，按“2.2”項下來計算鞣質提取率分別為5.16%、5.57%、5.98%、5.97%、5.96%，故選取乙醇濃度70%。2.3.2液料比稱取干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，分別加入40%的乙醇10、20、30、40、50 mL于100 mL容量瓶中，超聲時間為60 min，按“2.2”項下計算鞣質提取率分別為4.29%、5.31%、5.76%、5.56%、5.58%，故選取液料比30∶1。

2.3.3 超聲提取時間稱取下干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，加入50%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中，分別超聲提取30、40、50、60、70 min，按“2.2”項下計算鞣質提取率分別為4.22%、5.41%、5.58%、5.81%、5.67%，故選取提取時間60 min。

2.3.4 超聲提取溫度稱取下干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱定，加入70%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中超聲提取60 min，分別在提取溫度30、40、50、60、70℃，按“2.2”項下計算鞣質提取率分別為4.22%、5.31%、5.45%、4.35%、3.67%，故選取超聲提取溫度為50℃。溫度高于50℃時，鞣質易發生變質［9］，故采用冷凝水控制超聲溫度在50℃左右［10］。

2.4 響應面法優選

以單因素試驗為基礎，上述4個自變量對金櫻子中鞣質提取效果的影響程度較大的有乙醇百分濃度、超聲提取時間、液料比，因提取溫度的溫度范圍較小，所以對鞣質提取率影響亦較小，所以通過CCD法對鞣質提取率影響較大的超聲提取時間、乙醇百分濃度及液料比3個因素進行優選，以鞣質提取率為因變量，設計了分別用代碼-α，-1、0、1、α（α=1.732）表示的三變量五水平實驗，變量水平見表1，試驗安排和結果見表2。

表1 金櫻子中鞣質超聲提取工藝優選試驗變量水平

將表2中數據運用Design-Expert 7.0.0軟件進行響應曲面分析，以鞣質提取率（Y）為響應值分別對各因素進行多元線性回歸和二項式方程擬合，得多元線性回歸為：Y=5.53+0.11A+0.27B+0.27C（r=0.7908），說明模型擬合度和預測性較差，即多元線性模型不適合；故重新采用二項式擬合，得二項式模型為：Y=5.84+ 0.11A+0.27B+0.27C+0.046AB+0.044AC+0.029BC-0.043A2-0.26B2-0.14C2（r=0.9797），表明二次回歸方程擬合度以及可信度均較好。采用此模型進行分析和預測，其方差分析見表3。

表2 金櫻子鞣質超聲提取工藝優選試驗安排和結果

表3 金櫻子鞣質試驗設計方差分析

由方差分析表3可見，該回歸模型P＜0.0001，表明該模型差異有高度統計學意義，失擬項P= 0.1068＞0.05，表明失擬項差異無統計學意義，從而說明該模型能對金櫻子鞣質提取率進行準確分析和預測。一次項B-料液比和C-超聲提取時間：P＜0.0001，表明差異有高度統計學意義；A-乙醇百分濃度：P=0.0002＜0.01，表明差異有高度統計學意義；同理二項式B2和C2極其顯著；A2具有顯著性；交互項AB、BC和AC不顯著；說明不同的提取工藝條件對金櫻子鞣質提取率不是簡單的線性關系。

根據所擬合的回歸模型，作相應的響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面形狀，分析乙醇百分濃度、料液比和超聲提取時間對金櫻子鞣質提取率的影響，其3D響應曲面圖和等高線圖，見圖1～3。這3個圖較直觀地反映了乙醇百分濃度、料液比和超聲提取時間對響應值鞣質提取率的交互影響，同時等高線的形狀可反應交互效應的大小強弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。

運用Design-Expert 7.0.0軟件對二項式回歸模型進行預測分析，得最佳提取工藝為乙醇濃度71.02%，料液比1∶37.3，提取時間61.18 min，提取率預測的最大值6.19%。

圖1 乙醇濃度和料液比的3D響應面圖和等高線圖

圖2 料液比和提取時間的3D響應面圖和等高線圖

圖3 提取時間和乙醇濃度的3D響應面圖和等高線圖

2.5驗證實驗

驗證響應曲面法所得到的最優條件，檢驗得到的結果是否可靠，在最佳條件下分別提取了3次（考慮到實際操作的情況，將鞣質最佳提取條件修正為料液比1∶30、超聲時間為60 min、乙醇濃度為75%），提取溫度為50℃，結果金櫻子鞣質平均提取率為6.10%，與預測值的偏差0.94%，偏差不大吻合較好，說明優選的提取超聲工藝預測性良好。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

超聲提取現已應用于大部分植物化學成分的提取［13］，利用超聲輻射產生的強烈擾動效應、空化效應等多種效應來增加物質分子運動速度、頻率、溶劑的穿透力以及加速提取成分進入溶劑，這樣就能避免高溫對提取成分造成的影響。鞣質為結構復雜的多酚類化合物［14］，是一類熱不穩定成分。因此本實驗采用超聲波提取金櫻子中鞣質，節能省時，且能有效地提高金櫻子鞣質的提取率。

3.2 單因素的考察

通過單因素與星點設計-響應面法相結合的試驗方法，對金櫻子中總鞣質的提取工藝進行了優選。因響應面優化的前提是所設計的實驗點應包括較佳的實驗條件，一旦實驗點選取不當，就不能得到較好的優選結果。因此本實驗在進行星點設計之前，對可能影響金櫻子中鞣質提取率的各因素分別進行考察，確定了各個因素的較佳水平，并縮小了各因素的水平范圍，這對于通過效應面法優選較佳提取工藝有利，也有利于預測結果的準確性。

基于Design-Expert 7.0.0試驗設計軟件，通過二次回歸得到了金櫻子鞣質提取率與乙醇百分濃度、液料比、超聲提取時間的二次回歸模型，經方差分析得出該回歸模型是合理可靠的，能較好地預測金櫻子鞣質提取率。再利用該模型的響應面及其等高線直觀得出對影響金櫻子鞣質提取率較大因素的相互作用，得到最優工藝為：乙醇百分濃度為75%，超聲提取時間為60 min，液料比為1∶30，超聲提取溫度為50℃。因此，利用星點設計-響應曲面法對金櫻子鞣質超聲提取工藝進行優選，能獲得最優的工藝條件，這樣能有效減少工藝操作的盲目性，簡單易行、省時節能且提取效率高，為金櫻子鞣質的開發利用提供實驗依據，對其他類藥材中鞣質的提取有著一定的參考依據。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：206，附錄62，附屬XB.

［2］劉眾，高智席，李麗，等.金櫻子中蘆丁和槲皮素不同提取方法的比較研究［J］.安徽農業科學，2011，39（8）：4521-4522.

［3］劉學貴，李佳駱，高品一，等.藥食兩用金櫻子的研究進展［J］.食品科學，2013，34（11）：392-398.

［4］鄭榮梁，黃中洋.自由基生物學［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［5］Sharif T，Auger C，Alhosin M，et al.Red wine polyphenols cause growth inhibition and apoptosis in acute lymphoblastic leukaemia cells by inducing a redox-sensitive up-regulation of p73 and down-regulation of UHRFl［J］. Eur J Cancer，2010，46（5）：983-994.

［6］Kleijnen JPC，Hertog D，Angun E，et al.Response surface method-ology'S steepest ascent and stepsize revisited Crrection［J］.Eur J Operational Res，2006，17（1）：664.

［7］韓偉，劉傲霞，成悅，等.星點設計—效應面優化法在中藥提取中的應用［J］.機電信息，2013，26（9）：1-5.

［8］王添敏，孫曉麗，彭雪，等.胡桃楸的根、莖枝、葉和果皮中總鞣質的含量測定［J］.中國中藥雜志，2011，36（1）：32-36.

［9］俞文婕，王添敏，翟延君，等.星點設計-效應面法優化胡桃楸莖枝中總鞣質提取工藝［J］.中成藥，2013，35（7）：1419-1424.

［10］陳毅挺，林明峰，鄭水欽，等.翻白草中鞣質的超聲提取工藝研究［J］.閩江學院學報，2010，31（2）：107-110.

［11］林芳花，彭永宏，沈翠霞，等.金櫻子鞣質含量測定及其抗氧化提高生育力的實驗研究［J］.中國野生植物資源，2012，31（4）：15-17.

［12］王坤，魯靜.中藥材中鞣質含量測定方法的研究［J］.中國藥事，2004，18（6）：361-364.

［13］薛峰，李春娜，李明收，等.超聲提取在中藥化學成分提取中的應用［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20（18）：231-234.

［14］張愛武，劉樂樂，羅素琴，等.正交試驗優選蒙藥狗尾草果實中總鞣質的提取工藝研究［J］.內蒙古醫科大學學報，2013，35（3）：216-218.

Analysis of influence factors on extraction rate of tannin from Rosa Lae鄄vigatae Fructus and optimization of extraction condition

YAN Jianxin1，2WANG Xiaoli2▲
1.Department of Pharmacy,Guizhou People's Hospital,Guizhou Province,Guiyang550001,China;2.College of Pharmacy,Guiyang Medical University,Guizhou Province,Guiyang550004,China

ObjectiveTo optimize the process of ultrasonic extracting effective constituents from Rosa Laevigatae Fructus of tannin.MethodsThe content of tannin was determined by phosphomolybdotungsitc acid-UV spectmphotometry solvent.Based on single-factor tests,with ethanol percent,solid-liquid ratio,extraction time as independent variables and yield of tannin from Rosa Laevigatae Fructus as dependent variable,multiple linear regression and binomial fitting was adopted by central composite design model,and determine optimum extraction technology,and the forcast analysis was done.ResultsThe best extraction process was as followed:the concentration ethanol of 75%,ratio of solid-liquid of 1∶30,extraction time of 60 min,extraction temperature of 50℃.ConclusionThis optimized extraction process is simple and reliable,it can laid a certain foundation for development and utilization of tannins from Rosa Laevigatae Fructus.

Rosa Laevigatae Fructus;Tannin;Ultrasonic extraction;Response surface method

R284.2

A

1673-7210（2015)02（b)-0099-04

2014-11-14本文編輯：衛軻）

貴州省中藥現代化科技產業研究開發專項項目（編號：黔科合ZY字［2012］3004）。

▲通訊作者