海南產紅樹植物老鼠中2-苯并唑啉酮分離鑒定及含量測定

張宏武 丁 剛 李榕濤 魏建和 鄒忠梅

1.中國醫學科學院北京協和醫院藥用植物研究所，北京100193；2.中國醫學科學院北京協和醫院藥用植物研究所海南分所，海南萬寧571533

張宏武1丁 剛1李榕濤2魏建和1鄒忠梅1

1.中國醫學科學院北京協和醫院藥用植物研究所，北京100193；2.中國醫學科學院北京協和醫院藥用植物研究所海南分所，海南萬寧571533

目的分離制備海南產紅樹植物老鼠簕中指標性成分并建立其含量測定方法。方法選擇老鼠簕高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）色譜中的主要成分作為其指標性成分進行分離鑒定，并應用HPLC建立其含量測定方法，色譜條件為：Shiseido（Pak-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0 mL/min；檢測波長：270 nm，柱溫：30℃。結果從老鼠簕中分離鑒定了1個生物堿成分2-苯并唑啉酮，并建立了HPLC含量測定方法，在0.004 32～1.08 mg/mL范圍內呈良好的線性關系（r=0.9999，n=5）。平均回收率（n=9）為97.54%。結論本方法準確、簡便，重復性好，可用于海南產老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮的含量測定。

老鼠簕；生物堿；高效液相色譜法

紅樹植物（Mangrove plants）是熱帶、亞熱帶海區潮間帶特有的木本植物，我國利用紅樹植物作為藥用已有較長的歷史，尤其是民間用藥。老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）為爵床科老鼠簕屬植物，又名老鼠怕、軟骨牡丹、蚧瓜等，其性寒，味淡，全株或根入藥，為紅樹林重要的藥用植物之一，與其他紅樹林植物共生于海灘及淺海中。全世界共有50種，其中屬于紅樹林的老鼠簕、小花老鼠簕（A.ebracteatus Vahl）和廈門老鼠簕（A.xianmensis Zhang）主要分布在我國廣西、廣東、海南、臺灣、福建和浙江南部沿海海岸［1］。民間廣泛用于治療急慢性肝炎、哮喘、風濕病、麻痹癥、蛇傷等，有鎮痛和抗感染作用。在海南民間常用老鼠簕消腫、解毒、治療淋巴結腫大、急性肝脾疼痛、黃疸、胃痛和哮喘，將其根搗碎水煮，加上蜂蜜口服，是治療乙型肝炎的特效藥［2］。現代藥理研究發現，其具有抗肝纖維化［3］和抗氧化［4-5］、抗腫瘤［6］、抗菌［7］、抗感染鎮痛［8］、預防骨質疏松［9］等作用。化學成分研究表明老鼠簕主要含有生物堿、黃酮類、皂苷、甾醇類化學成分［10-14］，其中生物堿類成分是其抗感染、止痛活性的主要物質基礎。有研究表明：老鼠簕中的2-苯并唑啉酮具有殺利什曼原蟲的作用［15］。目前尚未見對海南產老鼠簕植物質量控制的報道，為了開發利用海南的紅樹植物資源，筆者首次對海南產紅樹植物老鼠簕藥材的質量做了進一步的評價，對老鼠簕中的指標性成分——2-苯并唑啉酮，進行了分離制備和結構測定，并首次對其海南產8批老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量進行了測定。該方法可靠、靈敏、重復性好，可以很好地控制藥材的質量，為海南產老鼠簕藥材的質量標準的制訂提供了參考依據。

1 儀器與試藥

儀器Fisher-Johns熔點儀（溫度未校正）；Bruker-AM600核磁共振波譜儀（TMS做內標）；996-2487高效液相色譜儀（美國Waters公司）：600泵；PDA紫外可見檢測器；empower工作站，電子天平（MSA125P-100-DU，賽多利斯，德國）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。柱色譜Sephadex LH-20為Pharmacia公司產品，薄層色譜及柱色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產品。

試劑：色譜乙腈（Burdick&Jackon，美國）；娃哈哈純凈水；其余試劑均為北京化學試劑公司產分析純試劑。

樣品：8批海南產老鼠簕樣品分別于2008、2009年采自海南文昌、瓊山地區，由中國醫學科學院海南分所助理研究員李榕濤鑒定為爵床科老鼠簕屬植物A-canthus ilicifoliusL.的根。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取老鼠簕藥材1 kg，粉碎機粉碎，過40目篩，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液減壓回收溶劑至無醇味，得浸膏115 g，將115 g浸膏加適量水混懸后，用8倍量乙酸乙酯萃取3次。合并萃取液，并減壓濃縮，得到乙酸乙酯部分5 g。將乙酸乙酯部分反復經硅膠（100～200目）柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）系統梯度洗脫，并經Sephadex LH-20凝膠柱分離，用二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到化合物32.8 mg，經NMR鑒定為2-苯并唑啉酮。

2.2 2-苯并口惡唑啉酮對照品核磁數據

1H-NMR（600 MHz，CDCl3），δ7.21（1H，dd，H-7），7.16（1H，dd，H-4），7.12（2H，td，H-5，6）。13C-NMR（150 MHz，CDCl3），156.2（C-2），144.1（C-7a），129.5（C-3a），124.4（C-5），123.0（C-6），110.4（C-4），108.5（C-7）。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido（Pak-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm）（日本）；流動相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。按2-苯并唑啉酮峰計算，理論塔板數不低于4500。此色譜條件下，待測組分與其他組分均達到基線分離，符合定量要求。色譜分離見圖1。

圖1 老鼠簕樣品和2-苯并口惡唑啉酮對照品的高效液相色譜圖

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 供試品溶液的制備取老鼠簕藥材2.0 g（過60目篩）置于50 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL甲醇，搖勻，充分溶解后，稱重，超聲提取20 min（功率：200 W；頻率：40 kHz），冷卻，加適量甲醇復重，再次超聲提取20 min，冷卻，加適量甲醇復重，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇溶解，定量轉移至5 mL量瓶中，冷卻，加甲醇至刻度，搖勻。0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液，備用。

2.3.3 標準曲線性的測定

2.3.4 檢測限及定量限

精密量取“2.3.3”項下對照品溶液定量稀釋，以信噪比S/N為3∶1，測得2-苯并唑啉酮的最低檢測限為0.43 ng/mL；以信噪比S/N為10∶1，測定2-苯并唑啉酮最低定量限為1.73 ng/mL（S/N≥10）。

2.3.5 重復性試驗

精密稱取同一批老鼠簕藥材粉末5份，按“2.3.2.1”項下供試品溶液制備方法制備5份供試品液，按照“2.3.1”項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖，結果各共有峰相對保留時間的RSD小于1%，相對峰面積的RSD為0.95%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 精密度試驗

取同一對照品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件下重復進樣測定5次，記錄色譜圖，結果各共有峰相對保留時間的RSD小于1%，相對峰面積的其日間精密度的RSD為0.52%，日間精密度的RSD為1.70%。表明該方法精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗

取同一批次供試品溶液，分別于0、4、8、24、48 h分別按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果各共有峰相對保留時間的RSD小于1%，相對峰面積的RSD為1.2%。表明供試品在48 h內基本性良好。

2.3.8 回收率試驗

精密稱取同一已知含量的老鼠簕藥材粉末約1.0 g，共9份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，每3份一組，按老鼠簕藥材中對照品含量的120%、100%、80%，即高、中、低濃度分別加入適量2-苯并唑啉酮對照品溶液（1.13 mg/mL），然后按“2.3.2.1”項下供試品溶液制備方法制備，測定結果，計算得到高、中、低濃度2-苯并唑啉酮的加樣回收率分別為97.55%、97.27%、97.80%，平均加樣回收率為97.54%，RSD為 0.97%（n=3），結果見表1。

表12 -苯并口惡唑啉酮加樣回收率（n=3）

2.3.9 樣品測定

取8批老鼠簕藥材粉末，按“2.3.2.1”項下供試品溶液制備方法制備樣品，按照“2.3.1”項下色譜條件進行測定老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮的含量。結果見表2。

表2 老鼠簕藥材中2-苯并口惡唑啉酮含量測定結果（n=3）

3 討論

3.1 對照品的選擇

3.2 提取方法的選擇

本實驗曾分別用二氯甲烷、95%乙醇和甲醇作為提取溶劑，超聲提取老鼠簕中2-苯并唑啉酮：提取2次，每次20 min，合并濾液，純甲醇定容于5 mL量瓶中，高效液相色譜（HPLC）測定結果發現甲醇提取物中2-苯并唑啉酮最高。在確定提取溶劑后，又對甲醇超聲提取和回流提取方式及提取次數進行了考察，結果表明：甲醇超聲提取和回流提取對老鼠簕中2-苯并唑啉酮的含量影響不大，考慮到超聲提取方法簡便，易行，故選擇超聲提取方法，作為提取方法。對提取時間的考察：分別提取10、20、45、60 min，10 min不能完全提取，20 min和45 min結果基本相同，而60 min的結果比45 min略低，故選擇提取20 min。所以最后確定提取方法為：甲醇超聲提取2次，每次20 min。

3.3 流動相的篩選

本試驗對甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水這三種流動相系統進行了篩選比較，結果發現甲醇-水系統和甲醇-0.1%甲酸水系統存在色譜峰拖尾的現象，而換用乙腈-水系統即可得到滿意的色譜峰形，同時與其他雜質峰的分離度也很高。故選擇乙腈-水系統作為流動相，并調節流動相，最終選擇乙腈-水（35∶65）作為洗脫溶劑，老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮與其他組分得到較好的分離，且峰形對稱，出峰時間適宜，適合作為老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮含量測定用流動相。

3.4 耐用性的考察

本實驗換用Agilent（SB-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），用適當乙腈和水等度洗脫，2-苯并惡唑啉酮也達到基線分離，結果表明該方法耐用性較好。

3.5 柱溫和檢測波長的選擇

本實驗采用30℃柱溫，可以減少流動相黏度、降低柱壓并改善分離效果，同時降低環境對分離的影響程度，故將柱溫定為30℃。用二極管陣列檢測器在波長190～400 nm范圍內進行全波長掃描，通過觀察2-苯并惡唑啉酮的紫外圖譜，發現2-苯并惡唑啉酮在270 nm左右處有最大吸收，并且在270 nm處測定基線波動小，峰形理想，樣品中其他組分干擾小，所以選擇270 nm作為HPLC的檢測波長。

本方法直接進樣，不需要進行前處理，雜質峰與樣品峰能達到基線分離，且在該色譜條件下2-苯并惡唑啉酮對照品峰形均勻對稱，證明本方法簡便、準確、快速，重復性好，且該方法的重現性、穩定性、精密度、回收率試驗均均能滿足定量的要求，且專屬性好，故可以用于海南產紅樹植物老鼠簕中2-苯并惡唑啉酮的含量測定。

3.6 樣品測定結果

從海南不同產地的8批老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮含量測定的結果來看，8批老鼠簕藥材中2-苯并惡唑啉酮含量差異比較大，因此有必要對老鼠簕藥材的采集、種植做進一步的系統研究及規范，從而保證老鼠簕藥材質量的穩定性。

［1］林鵬.中國紅樹林環境生態及經濟利用［M］.北京：高等教育出版社，1995：19.

［2］華南植物研究所.南海植物志［M］.2卷.北京：科學出版社，1974：180.

［3］梅燕，候軟玲，劉琳，等.老鼠簕乙醇提取物對肝纖維化大鼠COX-2和TGFβ1表達的影響［J］.時珍國醫國藥，2012，23（4）：888-890.

［4］胡忠，吳奕瑞，黎寶榮，等.老鼠簕類黃酮的提取及生理活性研究［J］.汕頭大學學報：自然科學版，2007，22（3）：49-54.

［5］Babu BH，Shylesh BS，Padikkala J.Antioxidant and hepatoprotective effect of Acanthus ilicifolius［J］.Fitoterapia，2001，72：272-277.

［6］Babu BH，Shylesh BS，Padikkala J.Tumour reducing and anticarcinogenic activity of Acanthus ilicifolius in mice［J］. Journal of Ethnopharmacology，2002，79：27-33.

［7］Ravikumar S，Raja M，Gnanadesigan M.Antibacterial potential of benzoate and Phenylethanoid derivatives isolated from Acanthus ilicifolius L.leaf extracts［J］.Nat Prod Res，2012，26（23）：2270-2273.

［8］王宗英，陳永好，鄭廣進，等.老鼠簕生物堿A及其衍生物乙酸老鼠簕生物堿A的抗炎鎮痛作用［J］.中國醫院藥學雜志，2011，31（10）：807-810.

［9］Phan VK，Tran HQ，Tran TH，et al.Chemical constituents ofAcanthusilicifoliusL.andeffectonosteoblasticMC3T3E1 cell［J］.Archives of Pharmacal Research，2008，31（7）：823-829.

［10］Minocha PK，Tiwari KP.A triterpenoidal saponin from roots of Acanthus illicifolius［J］.Phytochemistry，1981，20：135-137.

［11］彭興，龍盛京.老鼠簕的化學成分研究［J］.中草藥，2006，37（7）：971-973.

［12］霍長虹，趙玉英，梁紅，等.老鼠簕化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2005，30（10）：763-765.

［13］劉泉，林文瀚.中國南海紅樹植物老鼠簕的化學成分研究［J］.哈爾濱商業大學學報：自然科學版，2008，24（6）：648-651.

［14］霍長虹，王邠，梁紅，等.紅樹林植物老鼠簕化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2006，31（24）：2052-2054.

［15］Kapil A，Sharma S，Wahidulla S.Leishmanicidal activity of 2-Benzoxaolinone from Acanthus ilicifolius in vitro［J］. Planta Med，1994，60（2）：187-188.

Isolation,identification and quantitative analysis of 2-Benzoxzololinone in Mangrove Acanthus ilicifolius L.from Hainan Province

ZHANG Hongwu1DING Gang1LI Rongtao2WEI Jianhe1ZOU Zhongmei1
1.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College, Beijing100193,China;2.Hainan Branch Institute of Medicinal Plant,Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College,Hainan Province,Wanning571533,China

ObjectiveTo reporte the isolation of 2-Benzoxzololinone alkaloid from the roots of Acanthus ilicifolius L. and establish a HPLC method to determine the content of the 2-Benzoxzololinone alkaloid in the root of Mangrove A-canthus ilicifolius L.from Hainan Province.MethodsA Shiseido(Pak-C18)(5 μm,4.6 mm×150 mm)column was used with a mobile phase of acetonitrile-water(35∶65).The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was setted at 30℃.The detection wavelength was 270 nm.ResultsThe linear range of 2-Benzoxzolol was 0.004 32～1.08 mg/mL (r=0.9999,n=5)and the average recovery(n=9)was 97.54%.ConclusionThe method is accurate,simple,reproducible,and can be used to determine the content of 2-Benzoxzololinone alkaloid in Acanthus ilicifolius L.from Hainan Province.

Acanthus ilicifolius L.;Alkaloid;HPLC

R284

A

1673-7210（2015)02（b)-0106-04

2014-10-31本文編輯：衛軻）

張宏武（1977.5-），女，碩士，主要從事天然產物化學研究。

鄒忠梅（1964.4-），女，博士，博士生導師，主要從事天然產物化學研究。