淀粉質食品中蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定

張 鋒，于 倩，徐 艷，顧 敏，楊 靜

(甘肅省分析測試中心，甘肅蘭州 730000)

淀粉質食品中蠟樣芽孢桿菌的分離鑒定

張 鋒，于 倩*，徐 艷，顧 敏，楊 靜

(甘肅省分析測試中心，甘肅蘭州 730000)

[目的]分離鑒定淀粉質食品中的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。[方法]以淀粉質食品(低溫保藏的米飯)為原料，采用傳統方法對米飯中蠟樣芽孢桿菌進行分離鑒定，使用PCR技術做最終確定。[結果] 對低溫保藏米飯進行系列稀釋后在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基平板上進行菌種分離，初步分離出菌株MF-2，表面光滑稍有光澤，呈現低凸起形，邊緣呈現鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明；經革蘭氏染色為陽性，鏡檢為桿狀；經芽孢染色為有芽孢桿菌； MF-2號菌能利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，并產酸，但不能分解D-甘露糖和α-乳糖,初步鑒定菌株MF-2為蠟樣芽孢桿菌。由16S rRNA基因序列同源性分析，結合形態觀察和生理生化鑒定，最終鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。 [結論] 研究可為食品質量安全提供理論和實踐依據。

蠟樣芽孢桿菌；PCR技術；分離；鑒定

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種革蘭氏陽性桿菌，能形成芽孢，在周圍環境中廣為存在，其中一些菌株極易污染食物而引起食物中毒，特別是在蛋白質和碳水化合物含量豐富的食品中，如乳類、米飯、奶制品、腐乳、魚、燒雞等。因食品沒有明顯的腐敗現象，除有時稍有發粘口感不爽外，感官基本正常，因此不易察覺，誤食幾率較大。此類蠟樣芽孢桿菌主要引起8種類型的食物中毒癥狀，主要表現為嘔吐及腹瀉癥狀；此外，它們還能引起傷口及眼睛的感染等其他一些非腸胃性感染[l-2]。

目前，我國對蠟樣芽孢桿菌采用的檢測方法為國家標準GB.14938-94及檢驗檢疫系統行業標準WS/T.82-1996[3]。整個檢測過程費時低效，造成貨物積壓，貨主經濟損失增大[4]。而PCR技術現已廣泛應用于生物及食品學科等眾多領域，尤其是在食品中致病微生物檢測方面具有很大的應用價值[5]。實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且采用全密閉管檢測，不需后處理，避免交叉污染，具有特異性強、自動化程度高的特點[6]，并可有效解決PCR污染問題；PCR與其他的分子生物學技術的聯合應用[7]，使人們可定性、定量研究微生物菌落結構組成及數量變化，深入探索微生物菌落與環境因子之間的相互作用及其動態變化過程，為全面快速準確地分析鑒定水體、空氣、土壤和食品等環境中的各種微生物提供了一種嶄新的技術工具和平臺。為此，筆者以淀粉質食品為來源采用PCR技術對其可能含有的蠟樣芽孢桿菌進行分離鑒定，以期為食品質量安全提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試原料。米飯冷卻后在冰箱中冷藏2 d后備用。

1.1.2主要試劑。氯化鈉、氫氧化鈉，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心，分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，石家市旭瑞化工有限公司；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液；革蘭氏染色：草酸銨結晶紫染液，碘液，95%乙醇溶液，番紅染色液；芽孢染色：5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅染色液。

1.1.3主要儀器與設備。生化培養箱(SPX-250B-2)、數顯不銹鋼電熱培養箱(HPX-9272MBE)，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；電熱恒溫培養箱(DNP-9272)，上海精宏實驗設備有限公司；手提式壓力蒸汽消毒器(YXQ·SG4b·280A)，上海醫用核子儀器廠；超凈工作臺(SW-CJ-100)，蘇州安泰空氣技術公司；干燥箱(GRX20)，上海精密科學儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器(SHA-B)，金壇市醫療儀器廠；顯微鏡(XS-213A)，南京江南光電股份有限公司；紫外可見分光光度計(UVmini-1240)，尤尼柯(上海)有限公司；凝膠成像系統(BIO-RAD)，美國伯樂；PCR儀(TC-512)，英國TECHNE。

1.2 方法

1.2.1培養基的配制。

1.2.1.1主要培養基。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基。成分：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.6～7.8。制法：將除瓊脂以外在各成分溶解于水中，以NaOH溶液校正pH 7.6～7.8，分裝三角瓶(分裝以三角瓶容積的1/2～2/3為宜)，而后按培養基的量加入2%在瓊脂，0.1 MPa滅菌20 min后倒平板備用。

1.2.1.2細菌糖發酵培養基。糖發酵試驗——用于鑒定一般細菌糖或醇發酵試驗。成分：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.4，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液(BCP)1～2 ml，葡萄糖(或其他糖、醇，如：D-甘露糖、蔗糖、α-乳糖、麥芽糖)10 g。制法：將蛋白胨、氯化鈉和磷酸氫二鉀溶于蒸餾水中，校正pH，加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，待呈紫色，在加入葡萄糖(或其他各糖)，使之溶解，分裝于試管中，最后將杜氏小管倒置放入試管中，使管內充滿培養液無氣泡。

1.2.2菌種的分離培養。

1.2.2.1制備稀釋液。 稱取米飯10 g，放置于盛有90 ml無菌生理鹽水并帶有玻璃珠的三角瓶中，在水浴恒溫振蕩器中振蕩約2 h，使米飯與水充分混合，使細胞分散，即成為10-1稀釋度的米飯懸液；用移液槍吸取1 ml 10-1稀釋度的米飯懸液放入9 ml無菌生理鹽水混合均勻，即成為10-2稀釋度的米飯懸液；在用移液槍吸取1 ml 10-2稀釋度的米飯懸液放入9 ml無菌生理鹽水混合均勻，即成為10-3稀釋度的米飯懸液。如此反復，連續稀釋可依次制成10-3～10-7不同稀釋度的米飯稀釋液。

1.2.2.2平板接種培養。①倒平板：取無菌平皿6套，分別用記號筆標明10-4～10-6稀釋度各2套。取滅菌后冷卻至不燙手的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，分別倒入相應標號的無菌平皿約15 ml，平放桌上待凝固。②涂布平板：用移液槍分別吸取10-4～10-6稀釋度的米飯懸液各0.1 ml，傾注于相應標號的無菌平皿中，火焰旁左手拿培養皿，并用拇指將皿蓋打開一縫，右手持無菌玻璃涂棒，于平板培養基表面，將菌懸液自平板中央以同心圓方向輕輕向外涂布擴散，使之均勻分布。室溫下靜置5～10 min，使菌液侵入培養基，每個稀釋度接種2個平板。③培養：將接種的牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養1～2 d。

1.2.2.3革蘭氏染色。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染4個步驟。經此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，則該菌屬于革蘭氏陰性菌。

1.2.2.4芽孢染色。芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區別。芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難，因此，當先用弱堿性染料，如孔雀綠或堿性品在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用復染液(如番紅液)或襯托溶液(如黑色素溶液)處理，則菌體和芽孢易于區分。

1.2.3菌株生長曲線的測定與繪制。將分離的3種菌株(MF-1、MF-2、MF-3)分別接種入裝有牛肉膏蛋白胨培養液的三角瓶中，在37 ℃恒溫振蕩培養，分別在0、2、3、4、5、6、7、8、9 h…取出，以未接種培養液調零點，將搖勻后的培養液倒入比色槽中測定其OD600值。

1.2.4糖發酵試驗。蠟樣芽孢桿菌菌種的鑒定主要是依據菌株對碳水化合物的發酵產酸試驗，即通過對糖、糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來區分。如果發酵管中加入糖，培養2～3 d后，培養液出現黃色，則表示該糖被利用并產酸，反應為陽性；如無任何變化者則表示該糖不被利用，反應為陰性。

該試驗進行下列糖的糖發酵試驗: 葡萄糖、D-甘露糖、蔗糖、α-乳糖、麥芽糖。將糖發酵培養基成分(指示劑除外)稱取、溶解、搖勻，調整pH，添加1.6%溴甲酚紫指示劑，按1%的濃度添加試驗糖類并溶解，分裝試管，每管5 ml，在121 ℃下高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后待用。取分離出的3個菌株分別接種于糖發酵培養基中進行糖發酵試驗，另外做空白試驗對照，接種后，放置于37 ℃恒溫培養箱中培養48 h，觀察結果。

1.2.516S rRNA基因序列同源性分析。

1.2.5.1模板的制備。收集1.5 ml對數生長期細菌細胞；在10 000 r/min離心5 min，去除上清液；用TE緩沖液沖洗2次，加TE緩沖液0.5 ml，振蕩，最終重新懸浮于1.5 ml的離心管中。細胞顆粒溶于500 μl TE緩沖液中并混勻，加入10 μl溶菌酶，在37 ℃水浴鍋中加熱20～30 min；加30 μl 10% SDS，5 μl蛋白酶K，混勻，在55 ℃水浴中加熱30 min；加100 μl NaCl (5 mol/L)混勻，再加80 μl的CTAB/NaCl混勻；55 ℃水浴10 min。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻(如果分層不明顯，則重復此步驟)，在10 000 r/min離心10 min去除上清液，加入2倍體積的95%乙醇和0.1倍體積的醋酸鈉，在4 ℃冰箱中放置一個晚上，然后在10 000 r/min高速離心10 min，去除上清液，用70%乙醇沖洗2次，再加入200 μl TE緩沖液。

1.2.5.216S rRNA基因PCR擴增。 試劑：TaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司；引物：由上海生工有限公司合成；27f 5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3(對應于E.coli的16S rRNA的第8～27堿基位置)；1492r 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3(對應于E.coli的16S rRNA的1479～1492堿基位置)。

PCR反應體系(50 μl)：DNA模板(30～50 ng)，3 μl；dNTP混合物(終濃度:200 μmol),1 μl;TaqDNA聚合酶(1U),0.5 μl; 引物1為0.4 μmol，1 μl；引物2為0.4 μmol，1 μl；TaqDNA聚合酶10×緩沖液,5 μl;MgCl2，2 mmol/L,1 μl; 去離子水,37 μl。

1.2.5.3PCR產物檢測。3 μl擴增產物在1%瓊脂糖、50 μg/ml EB凝膠電泳上檢測，16S rRNA 基因大約1 450 bp，正向測序約700 bp。電泳結束后，置于BIO-RAD凝膠成像儀照相，保存為TIFF文件格式。

1.2.5.4PCR產物純化、測序[8-10]。 采用AxyprepTMPCR Cleanup Kit 純化PCR產物，擴增產物由上海生工生物技術有限公司進行測序。

1.2.5.5數據處理。將所測得的16S rDNA序列用提交到GenBank數據庫中，用BLAST進行相關序列的搜索，與GenBank、EMBL、DDBJ等數據庫中現有的近緣菌株的序列比較，并從數據庫獲得相關屬、相關種的16S rDNA序列，建立系統發育樹。序列用CLUSTAL X program軟件對齊，進化距離的計算應用鄰接法neighbor-joining method，采用p-distances法和Kimura-2parameter雙參數法進行，進化樹分支模式的穩定性用MEGA v.4.1軟件分析，采用bootstrap法，重復次數為1 000，構建進化樹。

2 結果與分析

2.1 純化培養(挑取單菌落)菌落特征的觀察和選擇：采用平板分離培養法長出的肉眼可見菌落，不同菌株的菌落形態特征各異，據此可在一定程度上鑒別微生物。從分離平板中選擇目的菌株的菌落進行純化培養。觀察菌落特征主要有：大小、表面形狀、隆起度、邊緣性狀、菌落性狀、表面光澤、菌落質地、顏色、透明度等。由此分離出3種菌株(MF-1、MF-2、MF-3)。

在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環，挑取菌懸液一環在培養基平板上劃線，劃線完畢，將牛肉膏蛋白胨平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養1～2 d。培養后在劃線平板上觀察沿劃線處長出的菌落形態特征，經涂片、染色和鏡檢為純種后再接種斜面。

菌落形態如圖1所示。MF-1：菌落為小菌落(2～3 mm)，表面光滑具有光澤，呈現低凸起形，邊緣整齊可形成圓形或近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色偏黃不透明。MF-2：菌落為小菌落(2～3 mm)，表面光滑稍有光澤，呈現低凸起形，邊緣呈現鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明。MF-3：菌落為小菌落(2～3 mm)，表面光滑稍有光澤，呈現低凸起形，邊緣呈現鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明。

2.2 革蘭氏染色涂片→干燥→固定→草酸銨結晶紫染液初染(1～2 min)→水洗→碘液媒染(1 min)→水洗→95%乙醇溶液脫色(30 s)→水洗→番紅復染(1～2 min)→水洗→濾紙吸干→鏡檢。

經革蘭氏染色，MF-1號菌呈現紅色，故為革蘭氏陰性菌，MF-2號菌和MF-3號菌呈現紫色，故為革蘭氏陽性菌(圖2)；且3種菌株都呈現為桿狀，故為桿菌。

2.3 芽孢染色制備菌懸液→染色(5%孔雀綠水溶液加熱染色15～20 min)→涂片、固定→脫色(水洗)→復染(0.5%番紅染色液染色2～3 min，傾去染液濾紙吸干)→鏡檢。

經芽孢染色后，MF-2號菌呈現為桿狀，芽孢為綠色，菌體為紅色，故為芽孢菌；MF-3號菌呈現為桿狀，均為紅色，故無芽孢(圖3)。

2.4 菌株生長曲線的測定與繪制以細菌懸液的光密度值(OD值)為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制出MF-2號菌的生長曲線，見圖4。

2.5 糖發酵試驗葡萄糖、蔗糖和麥芽糖發酵管顏色由原來的紫色變為黃色，則表示MF-2號菌能利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，并產酸；D-甘露糖和α-乳糖發酵管顏色為紫色，沒有變化，則表示MF-2號菌不能分解D-甘露糖和α-乳糖(表1，圖5)。

表1 MF-2號菌糖發酵試驗測定結果

培養基及試驗MF-2號菌結果葡萄糖+蔗糖+D-甘露糖-α-乳糖-麥芽糖+

注：“+”，“-”分別表示糖發酵試驗反應結果為陽性和陰性。

2.6 16S rRNA基因序列同源性分析DNA雜交后，同源性在70%以上屬于種的水平；在20%以上，所試驗的菌株可能屬于同一個屬的成員。16S rRNA基因序列分析法原理是：如果兩株細菌的親緣關系比較接近，那么它們的rRNA序列同源性比較高，一般認為序列同源性超過97.5%以上為同一個種。

對分離菌株進行PCR擴增得到菌株的16S rDNA，經過電泳檢測(圖6)，由上海生工公司測序，將所測得的16S rDNA序列提交到GenBank數據庫中，用BLAST進行相關序列的搜索，與GenBank、EMBL、DDBJ等數據庫中現有的近緣菌株的序列比較，并從數據庫獲得相關屬、相關種的16S rDNA序列，建立系統發育樹(圖7)。結果表明，菌株MF-2與蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)同源性達98%。根據分子生物學測序結果，結合形態觀察和生理生化現象，鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

3 結論

對低溫保藏米飯進行系列稀釋后在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基平板上進行菌種分離，初步分離出菌株MF-2，表面光滑稍有光澤，呈現低凸起形，邊緣呈現鋸齒狀，菌落形狀可形成近似圓形、質地松軟、無色素，菌落顏色為乳白色不透明；經革蘭氏染色為陽性，鏡檢為桿狀；經芽孢染色為有芽孢桿菌； MF-2號菌能利用葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，并產酸，但不能分解D-甘露糖和α-乳糖。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》,初步鑒定菌株MF-2為蠟樣芽孢桿菌。

由16S rRNA基因序列同源性分析，結合形態觀察和生理生化鑒定，最終鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。

[1] IROSHI FUKUSHIMA,YOSHIE TSUNOMORI,RYOTARO SEKI.DuPlex rea-time SYBR green PCR assays for deteetion of 17 species of food or water borne patho gens in stools[J].Journal of Clinical Microbiolog,2003,41(11):5134-5146.

[2] RUDI K, HOIDAL H K, KATLA T,et al.Ditect Real-time PCR quantification of Carnpylobacter jejuni in chicken fecal and cecal samples by intergrated cell concenteation and DNA Purification[J].Appl Environmental Microbiol, 2004,7(2):790-798.

[3] BACH H J,ERRARNPALLI D,LEUNG K T,et al. Specifie detection of the gene for the extra cellular neutral protease ofBacilluscereusby PCR and blot hybridization [J].Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(7): 3226-3228.

[4] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB4789.14-2003,食品衛生微生物學檢驗——芽孢桿菌檢驗標準[S].北京:中國標準出版社,2003.

[5] BJATNE MUNK HANSEN,NIELS BOHSE HENDRIKSEN.Detection of enterotoxicBacilIuscereusandBacillusthuringiensisstrains by PCR analysis[J].Applied and Environmental Microbiology,2001，67(1):185-189.

[6] YANG I O,SHIH D Y,HUAMG T P,et al.Establishlment of a novel multiplex PCR assay and detection of toxigenic strains of the species in the Baeillus cereus group[J]. Food Protect, 2005,68(10):2123-2130.

[7] 王振國,劉金華,徐寶梁,等.應用實時熒光PCR檢測致病性芽孢桿菌[J].生物技術通訊,2006,17(l):40-42.

[8] KOTIRANTA A,LOUNATMAA K,HAAPASALO M.EPidemiology and Pathogenesis ofBacilluscereusinfeetions[J].Microbes Infeot,2000,2(2):189-198.

[9] 孟靈,王應芳,李恕君.骨髓及血液中檢出芽孢桿菌1例[J].檢驗醫學與臨床，2007, 4(5):435-436.

[10] 沈圣,余娟,滕毅,等.TaqManTM實時熒光 PCR快速檢測芽孢桿菌的初步研究[J].中國衛生檢驗雜志,2006,16(12):1434-1436.

Isolation and Identification ofBacilluscereusin Starches

ZHANG Feng, YU Qian*, XU Yan et al

(Gansu Analysis Research Center, Lanzhou, Gansu 730000)

[Objective] To isolate and identificateBacilluscereusin starches. [Method] With starchy food(low temperature preservation steamed rice) as raw material, traditional method was adopted to isolate and identifyBacilluscereusin steamed rice, PCR technology was used for final determination. [Result] A sequence of dilution was conducted on low temperature preservation steamed rice, and bacteria isolation was carried out on beef extract peptone agar medium. MF-2 was preliminarily isolated. MF-2 bacteria could utilize glucose, sucrose and maltose, produce acid, but can not degrade D- galactose and lactose. Through 16S rRNA gene sequence homology analysis, combined with morphological observation and physiological and biochemical identification,Bacilluscereuswas identified finally. [Conclusion] The study can provide theoretical and practical basis for food quality safety.

Bacilluscereus; PCR technique; Isolation; Identification

張鋒(1981-)，男，甘肅慶陽人，助理研究員，從事食品科學、食品檢測研究。*通訊作者，碩士，從事農產品貯藏及加工、食品檢測研究。

2015-03-26

S 182

A

0517-6611(2015)13-263-04