異育銀鯽中科3號MSTN基因的克隆與序列分析

2015-01-15 12:18:57張穎李冰朱健蔣高中

江蘇農業科學 2014年11期

張穎+李冰+朱健+蔣高中

摘要：采用同源克隆和末端快速擴增（rapidamplicationofcDNAends，RACE）方法分離克隆了異育銀鯽（Allogyogeneticscruciancarp）中科3號肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）基因全長DNA，得到3394bp全長的DNA，包含3段外顯子和2段內含子，其中2098bp的全長cDNA在NCBI數據庫中進行序列比對后，確定為異育銀鯽中科3號MSTN基因。對推測的MSTN基因氨基酸序列進行同源性比對和系統分析顯示：MSTN基因在異育銀鯽與斑馬魚及其他魚類間的氨基酸序列相似度為73.5%～98.0%，與鯉魚MSTN基因相似度最高（98.0%），不同物種間MSTN的氨基酸序列較為保守。用半定量RT-PCR檢測MSTN基因在異育銀鯽心、腸、肌、腦、鰓和肝的相對表達量結果表明，MSTN基因在腦中含量最高，其次是肌、鰓、心、腸，在肝臟中含量最低。

關鍵詞：異育銀鯽；肌肉生長抑制素；同源法克隆；末端快速擴增法；序列分析；組織表達分析

中圖分類號：S917.4；Q785文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0040-05

鯽魚是我國重要的淡水經濟養殖魚類，異育銀鯽（Allogyogeneticscruciancarp）中科3號是當前主要的鯽魚養殖品種之一。該品種是中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室桂建芳研究員等技術人員利用銀鯽的雙重生殖方式，從高體型（D系）異育銀鯽（♀）與平背型（A系）異育銀鯽（♂）交配所產后代中選育出來，再經異精雌核培育而來的異育銀鯽第3代新品種[1]。中科3號異育銀鯽具有生長速度快、遺傳性狀穩定等優點[2-4]，作為經濟魚類，其肌肉的生長發育是重要的生長過程，受分子水平調控等多因素的影響[5]。

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）又稱生長分化因子-8（growthdifferentiationfactor-8，GDF-8），屬于轉化生長因子-β（transfominggrowthfactor-β，TGF-β）超家族，是肌肉發育和生長的負調控因子[6]。該基因是McPherron等于1997年在小鼠骨骼肌的cDNA文庫中發現的，試驗表明，MSTN基因敲除后的小鼠會發生肌細胞的增生與肥大，從而導致骨骼肌大量增加的現象[6]；牛中MSTN基因的自然缺失與突變也已被發現，突變結果導致MSTN基因失活，肌肉增生[7-8]。

目前，已有不少關于MSTN基因克隆及作用機制的研究，包括哺乳類[9-11]、鳥類[12-14]動物，在魚類的研究中，也有不少物種的MSTN基因被報道，包括斑馬魚（Daniorerio）[8，15]、虹鱒（Oncorhychusmykiss）[16]、大麻哈魚（Salmosalar）[17]、莫桑比克羅非魚（Oreochromismossambicus）[18]、斑點叉尾（Ictaluruspunctatus）[19]、石首魚（Umbrinacirrosa）[20]、奧利亞羅非魚（Oreochromisaureus）[21]、鳡魚（Elopichthysbambusa）[22]、軍曹魚（Rachycentroncanadum）[23]、牙鲆（Paralichthysolivaceus）[24]、勒氏笛鯛（Lutjanusrussellii）[25]、黃顙魚（Pelteobagrusefulvidraco）[26]、泥鰍（Misgurnusanguillicaudatus）[27]、真鯛（Chrysophrysmajor）[28]、鳙魚（Aristichthysnobilis）[29]等。魚類MSTN基因除在骨骼肌中表達外，還可在其他組織如腦、心臟、腎、腸、精巢、鰓、脾、眼、肝等中表達[22，30]，不同于哺乳動物和鳥類的表達譜[31-32]。試驗表明，MSTN基因功能缺失可以導致斑馬魚肌肉數量和體積的增加[15]。MSTN通過內分泌、自分泌和旁分泌3種不同的作用途徑發揮作用，可與成肌細胞膜上的受體結合而引起受體自身的磷酸化，啟動一系列信號傳導過程，最終抑制成肌細胞的增殖和分化[33]。MSTN作為肌肉生長發育相關的重要調控基因，其相關研究對了解魚類肌肉生長機理有重要作用。本試驗克隆了異育銀鯽MSTN基因，并對其序列和組織表達進行了分析。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用異育銀鯽中科3號質量約80g，購自揚州市江都區，取20尾于中國水產科學研究院淡水漁業研究中心（江蘇無錫）的育種實驗室進行暫養，用于RNA及DNA的提取。基因提取、反轉錄等試劑盒均購自TaKaRa公司（大連）。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA、基因組DNA的提取和cDNA模板的制備取試驗魚骨骼肌、腦、肝等6個組織，按RNAisoplus試劑盒的方法提取總RNA，使用基因組DNA提取試劑盒從全血中提取基因組DNA，用1%瓊脂糖電泳和分光光度計檢測所提基因的質量和濃度。按反轉錄試劑盒要求進行反轉錄，反應后置于-20℃保存。

1.2.2MSTN基因克隆與序列分析根據鯉魚（Cyprinuscarpio，GQ214770.1）和斑馬魚（Daniorerio，AY323521.1）的MSTN基因設計3對引物MSTNF1、MSTNR1，MSTNF2、MSTNR2，MSTNF3、MSTNR3（表1），用于擴增MSTNcDNA核心片段。根據所得序列設計用于5′RACE和3′RACE的特異性引物：MSTN5outer、MSTN5inner，MSTN3outer、MSTN3inner（表1），分別按照5′RACE和3′RACE試劑盒進行2輪擴增的巢式PCR。由鯉魚（Cyprinuscarpio，GQ214770.1）MSTN基因全序列設計2對引物MSTNF4、MSTNR4，MSTNF5、MSTNR5（表1）擴增2個內含子。擴增產物均在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，膠回收后經連接、轉化、擴大培養、酶切驗證后，將陽性克隆送至上海鉑尚生物技術有限公司測序。將所測序列登錄NCBI進行BLAST分析；用DNAstar軟件分析序列及開放閱讀框，并對其分子量、等電點、氨基酸組成等進行分析；用MEGA5.0軟件中的距離矩陣鄰接法（neighbor-joining）構建系統進化樹。

1.2.3半定量RT-PCR檢測取試驗魚骨骼肌、腦、肝、腸、心、鰓6個組織，提取總RNA，平衡起始濃度后，反轉錄成cDNA。根據拼接獲得的MSTN全長cDNA序列，設計半定量RT-PCR引物MSTNF6、MSTNR6（表1）和內參β-actin（GenBank：AB039726.2）基因引物βF、βR[34]（表1），以各組織的反轉錄產物為模板，用以上2對引物進行擴增。產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并拍照。

2結果與分析

2.1試驗結果

將PCR產物測序后進行比對，得到了異育銀鯽MSTN基因的完整DNA序列，包括416、360、454bp3段部分編碼序列，5′和3′兩端324、990bp序列，以及756、776bp2段內含子序列。經NCBI的BLAST序列比對，確認所得序列為鯽魚的MSTN序列。

2.2結果分析

2.2.1MSTN基因序列、氨基酸組成及特征位點分析以異育銀鯽骨骼肌cDNA為模板，經PCR擴增、膠回收、克隆和測序，去除載體序列和重疊序列，拼接得到2098bp的全長cDNA，其中5′端擴增得到268bp，5′UTR為89bp；3′端擴增得到934bp，3′UTR為881bp，詳見圖1，可以看出，該cDNA包括典型的轉錄終止信號序列（AATAAA）和polyA尾。用DNASTAR軟件預測可知，MSTN的分子量約為42.25ku，開放閱讀框為1128bp，編碼375個氨基酸，其中包含強堿性氨基酸（K、R）43個，強酸性氨基酸（D、E）47個，疏水性氨基酸（A、I、L、F、W、V）116個，極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）105個，等電點為6.55。BLASTP分析發現，異育銀鯽MSTN蛋白有2個典型的TGF-β蛋白結構域（圖1），1個是TGF-β前肽結構域，從第37位到第256位，共220個氨基酸殘基；另1個是TGF-β功能域，是TGF-β家族基因的活性區域，從第281位到第375位，共94個氨基酸殘基。信號肽預測結果顯示，N末端含有1個22個氨基酸組成的信號肽序列，切割位點位于22位的G和23位的D之間；碳端生物活性區含有9個保守的半胱氨酸殘基；異育銀鯽MSTN蛋白也有典型的RXXR蛋白酶水解位點，為RARR（第263-266位）；起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA（圖1）。總體看出，異育銀鯽與其他物種的MSTN基因特征相同[22-24]。

2.2.2異育銀鯽MSTN序列同源性與系統發育分析將異育銀鯽MSTN與其他動物MSTN的ORF序列進行同源性比較，結果見表2。

用DNAMANVersion6.0軟件，比較異育銀鯽與人、小鼠、原雞、斑點叉尾、斑馬魚、大馬哈魚、大西洋鮭、虹鱒、鰱魚、鯉和牙鲆的MSTN氨基酸同源性。結果顯示，異育銀鯽與上述物種的序列同源性分別為75.0%、73.5%、75.0%、88.1%、89.9%、91.3%、75.4%、76.9%、97.0%、98.0%、79.8%，異育銀鯽MSTN與鯉魚MSTN的遺傳距離最小，僅為0.020。

基于異育銀鯽MSTN氨基酸序列和公布的其他物種的相應序列，用MEGA5.0構建了脊椎動物MSTN的分子進化樹（圖2）。結果表明，整個進化樹分為2大分支，其中1支由人、哺乳類和禽類組成，另1支由魚類組成；異育銀鯽與鯉關系最近，與鯉魚、斑馬魚、鰱魚、斑點叉尾4種鯉形目魚類在1個分支里。由進化樹分析可知，所克隆到的MSTN基因屬于Ⅰ型，物種MSTN系統發育與物種間的親緣關系一致。

2.2.3異育銀鯽MSTN基因組織表達分析采用半定量RT-PCR方法檢測了MSTN基因mRNA在異育銀鯽鰓、心、腸、肝、腦、肌肉6個組織中的表達情況，圖3顯示，異育銀鯽不同組織均有1條70bp大小相同的條帶，條帶亮度具有組織差異性，在腦中表達量最高，在肌肉和鰓中表達量次之。以β-肌動蛋白基因為對照，進行了以上組織的RT-PCR檢測，在所檢測的組織樣品中均得到β-肌動蛋白基因的特意擴增條帶，說明不同組織中RNA的提取和反轉錄過程正常，模板cDNA完整，推測不同組織中檢測到的MSTN轉錄子存在的差異是各組織MSTN表達情況的自然表現。

3討論與結論

本研究采用分子克隆技術得到了異育銀鯽中科3號MSTN基因的基因組DNA序列全長，并通過半定量RT-PCR方法檢測了MSTN基因mRNA在異育銀鯽鰓、心、腸、肝、腦、肌肉6個組織中的表達情況。MSTN作為胞外信號分子，可與成肌細胞膜上的受體結合而引起受體自身的磷酸化，從而啟動細胞內一系列信號傳導過程，作用于生肌決定因子（MyoD）靶基因的調控區，調節肌肉組成蛋白和蛋白基因的表達。MSTN的生物學功能主要為抑制成肌細胞增殖和分化，其中抑制增殖是通過調控細胞周期進程來實現的，MSTN通過抑制生肌決定因子（MyoD、Myf5、MyoG）和P21的表達來可逆地抑制成肌細胞的分化。MSTN的信號傳導途徑是MSTN-ActRⅡB型受體（蛋白激酶受體）-Smad蛋白信號傳導通路，并通過內分泌、自分泌和旁分泌3種不同的途徑發揮作用[33]。

根據ClustalX2.0.11軟件對于異育銀鯽MSTN氨基酸序列進行的同源性比較結果以及利用MEGA5.0軟件的NJ方法構建的分子進化樹表明，異育銀鯽MSTN氨基酸序列與其他物種的相似度在73.5%～98.0%之間，符合魚類的分類地位和親緣關系，異育銀鯽MSTN基因的氨基酸與鯉魚的氨基酸相似度最高，其次是斑馬魚和鰱魚，它們同屬于鯉形目鯉科，親緣關系最近；大馬哈魚、虹鱒和大西洋鮭隸屬于鮭形目，因此與異育銀鯽的親緣關系較遠；原雞屬于鳥類，小鼠和人屬于哺乳綱，因此親緣關系最遠。研究發現MSTN基因在魚類中存在2個異構體；在斑馬魚、大西洋鮭、大馬哈魚、虹鱒和鯉魚中都發現了2種MSTN，根據與其他物種的MSTN基因序列及氨基酸序列比較分析，本研究得到的異育銀鯽MSTN基因與其他物種的MSTN-1同源性較高，推測所克隆的為異育銀鯽MSTN-1基因，是否存在MSTN-2則需進一步探究。

采用半定量RT-PCR技術對異育銀鯽鰓、心、肝、腸、腦、肌6個組織中MSTN的表達量進行檢測，結果在上述6個組織均有表達，根據條帶的明暗程度推斷，MSTN在上述組織中的表達水平依次為腦>肌≈鰓>心>腸>肝，與其他物種MSTN表達譜不同。MSTN在哺乳動物中主要表達于骨骼肌中，小鼠MSTN基因只在骨骼肌中表達[6]；在豬中，MSTN基因除了在骨骼肌中表達外，在乳腺中也有表達[35]；有研究表明，MSTN基因還在藏系綿羊真胃、瘤胃中表達[36]。與哺乳動物相比，MSTN基因在魚類中的表達更廣泛，可以在腦、心、腸、鰓、腎、眼睛、脾、性腺等多個組織中表達，但在不同魚類中表達情況也不一樣。該基因在鳡的肌肉、腦和心臟中均有表達[22]；而在鯉魚中MSTN僅在肌肉和腦組織中檢測到，在其他組織如心臟、精巢、眼睛和鰓中均未檢測到[37]；在斑馬魚中，MSTN的表達譜也較廣，在肝、心、胃、鰓、卵巢、精巢、腎、肌肉、眼、腦中均有表達[38]；在黃河裸裂尻魚中，MSTN的表達在心臟、肝胰臟、腎、肌肉、腦、脂肪、腸、鰓和精巢共9個組織中均能檢測到[30]。由此可見，MSTN基因的表達情況在魚類中有較大差異，由MSTN在異育銀鯽中的表達特征和表達水平分析可知，異育銀鯽MSTN基因除調控肌肉生長發育外，還有可能參與心肌發育調控和代謝等其他功能。

MSTN是肌肉生長的負調控因子，異育銀鯽MSTN基因的克隆為進一步研究異育銀鯽肌肉生長分化與調節及其他魚類該基因的克隆提供了依據，并為進行分子育種和其他應用創造了條件，人工控制MSTN的活性成為養殖業的一大課題。進一步可以有以下研究方向：利用分子標記技術選育肉質性狀優良的魚類；利用基因敲除技術獲得MSTN缺失魚類；利用RNAi技術干擾MSTNmRNA的表達篩選MSTN基因的抗體，開發飼料添加劑[38]。本試驗將繼續研究2代異育銀鯽MSTN基因的單核苷酸多態性（SNPs）并進行比較。在動物育種方面，SNPs作為一種分子標記輔助育種強有力的工具也得到了廣泛的應用，研究中會將SNPs與2個品種異育銀鯽體型及體質量增長進行相關性分析，以期為異育銀鯽分子標記輔助育種提供一定依據，確定有效的育種方案，并運用到生產實踐中，為養殖品種的選擇提供一定的依據。

參考文獻：

[1]桂建芳.異育銀鯽養殖新品種——“中科3號”簡介[J].科學養魚，2009（5）：21.

[2]高光明.中科3號銀鯽養殖與推廣綜述[J].養殖與飼料，2011（9）：12-14.

[3]陳學年，郭玉娟，王忠衛，等.異育銀鯽“中科3號”與豐產鯽形態特征及生長的比較研究[J].淡水漁業，2011，41（5）：83-87.

[4]黃慶，陳志剛，周衛華，等.異育銀鯽“中科3號”與第一代異育銀鯽生長對比試驗[J].科學養魚，2013（2）：19-20.

[5]趙浩斌，彭扣，王玉鳳，等.魚類肌肉生長抑制素研究進展[J].水生生物學報，2006，30（2）：227-231.

[6]McpherronAC，LawlerAM，LeeSJ.RegulationofskeletalmusclemassinmicebyanewTGF-βsuperfamilymember[J].Nature，1997，387（6628）：83-90.

[7]GrobetL，MartinLJ，PonceletD，etal.Adeletioninthebovinemyostatingenecausesthedouble-muscledphenotypeincattle[J].NatureGenetics，1997，17（1）：71-74.

[8]McpherronAC，LeeSJ.Doublemusclingincattleduetomutationsinthemyostatingene[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，1997，94（23）：12457-12461.

[9]金定恩，張力青，姚艷豐，等.豬肌生成抑制素基因去信號肽蛋白二級構預測和B細胞表位分析[J].生物技術通報，2008（增刊1）：264-270.

[10]王全喜，紅海，芒來.蒙古馬肌生成抑制基因（MSTN）的克隆及序列分析[J].華北農學報，2006，21（5）：45-49.

[11]KocamisH，KilleferJ.Myostatinexpressionandpossiblefunctionsinanimalmusclegrowth[J].DomesticAnimalEndocrinology，2002，23（4）：447-454.

[12]湯青萍，章雙杰，宋遲，等.不同鵝種肌肉生長抑制素基因表達差異研究[J].現代農業科技，2012（23）：257-259.

[13]張冉，林浴霜.不同品種雞MSTN基因表達差異的研究[J].中國家禽，2012，34（6）：61-63.

[14]WangYS，HouSS，HuangW，etal.MolecularcloningofmyostatinpartialcDNAofBeijingduckanditsexpressioninbreastmuscle[J].AgriculturalSciencesinChina，2006，5（6）：468-472.

[15]AmaliAA，LinCJ，ChenYH，etal.Up-regulationofmuscle-specifictranscriptionfactorsduringembryonicsomitogenesisofzebrafish（Daniorerio）byknock-downofmyostatin-1[J].DevelopmentalDynamics：anOfficialPublicationoftheAmericanAssociationofAnatomists，2004，229（4）：847-856.

[16]RescanPY，JutelI，RallièreC.Twomyostatingenesaredifferentiallyexpressedinmyotomalmusclesofthetrout（Oncorhynchusmykiss）[J].TheJournalofExperimentalBiology，2001，204（Pt20）：3523-3529.

[17]stbyeTK，GallowayTF，NielsenC，etal.ThetwomyostatingenesofAtlanticsalmon（Salmosalar）areexpressedinavarietyoftissues[J].EuropeanJournalofBiochemistry，2001，268（20）：5249-5257.

[18]RodgersBD，WeberGM，SullivanCV，etal.Isolationandcharacterizationofmyostatincomplementaryde-oxyribonucleicacidclonesfromtwocommerciallyimportantfish：OreochromismossambicusandMoronechry-sops[J].Endocrinology，2001，142（4）：1412-1418.

[19]KocabasAM，KucuktasH，DunhamRA，etal.MolecularcharacterizationanddifferentialexpressionofthemyostatingeneinChannelcatfish（Ictaluruspunctatus）[J].BiochimicaetBiophysicaacta，2002，1575（1/2/3）：99-107.

[20]MaccatrozzoL，BargelloniL，PatarnelloP，etal.Characterizationofthemyostatingeneandalinkedmicrosatellitemarkerinshidrum（Umbrinacirrosa，Sciaenidae）[J].Aquaculture，2002，205（1/2）：49-60.

[21]沈麗紅，熊良偉，唐永凱，等.奧利亞羅非魚MSTN基因結構及其SNPs的篩選[J].上海海洋大學學報，2010，19（2）：157-161.

[22]郁建鋒，張營，王星果，等.鳡肌肉生長抑制素（MSTN）基因的克隆及其組織特異性表達分析[J].水產學報，2010，34（10）：1486-1494.

[23]張銳，孫美榕，鄧思平，等.軍曹魚肌生成抑制素基因的克隆與序列分析[J].生物技術通報，2008（z1）：144-148.

[24]徐建勇，陳松林.牙鲆肌肉生長抑制素（MSTN）基因克隆[J].水產學報，2008，32（4）：497-506.

[25]鄧思平，李嘉穎，張婉玲，等.勒氏笛鯛（Lutjanusrussellii）肌肉生長抑制素基因的克隆與分析[J].廣東海洋大學學報，2011，31（6）：20-25.

[26]朱媛媛，梁宏偉，李忠，等.黃顙魚MSTN基因多態性及其與生長性狀的相關性分析[J].遺傳，2012，34（1）：74-80.

[27]彭扣，陳偉偉，胡煒，等.泥鰍肌肉生長抑制素基因片斷的克隆及其表達[J].水產學報，2007，31（2）：145-151.

[28]葉寒青，陳松林.真鯛肌肉生長抑素（MSTN）基因的克隆及表達分析[J].高技術通訊，2006，16（7）：718-724.

[29]LiuL，YuX，TongJ.Molecularcharacterizationofmyostatin（MSTN）geneandassociationanalysiswithgrowthtraitsinthebigheadcarp（Aristichthysnobilis）[J].MolecularBiologyReports，2012，39：9211-9221.

[30]晁燕，張輝，祁得林，等.黃河裸裂尻魚肌肉生長抑制素基因克隆及表達分析[J].動物學研究，2012，33（5）：473-480.

[31]毛亮，徐亞歐，楊孔.藏雞MSTN基因克隆與mRNA組織表達譜分析[J].中國家禽，2011，33（16）：21-25.

[32]胡蘭，郭東新，胡銳，等.大骨雞中MSTN基因表達規律性的研究[J].動物科學與動物醫學，2003，20（11）：42-44.

[33]羅鈞秋，陳代文.肌肉生長抑制素（MSTN）對肌肉調控的分子作用機制[J].黑龍江畜牧獸醫，2007（7）：36-38.

[34]徐磊，劉波，謝駿，等.甘露寡糖對異育銀鯽生長性能、免疫及HSP70基因表達的影響[J].水生生物學報，2012，36（4）：656-664.

[35]梁婧嫻，陳志成，鄭玉才，等.藏系綿羊MSTN基因在不同年齡不同組織的表達定量研究[J].農業科學與技術：英文版，2011，12（4）：608-612.

[36]JiS，LosinskiRL，CorneliusSG，etal.Myostatinexpressioninporcinetissues：tissuespecificityanddevelopmentalandpostnatalregulation[J].AmericanJournalofPhysiology，1998，275：R1265-R1273.

[37]李興美，范巍，張彬，等.鯉魚肌肉生長抑制素基因（MSTN）的克隆及其組織表達特征[J].水生生物學報，2007，31（5）：643-648.

[38]邵芳，盧祥云，顧志良.魚類MSTN基因的研究進展[J].常熟理工學院學報，2011，25（8）：76-80.