秈稻KraDangNgah成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的研究

2015-01-15 12:21:19張銀霞

江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年11期

張銀霞

摘要：為了建立秈稻KraDangNgah的再生體系，以其成熟胚作為試驗(yàn)材料，研究不同種類植物激素及其濃度配比對(duì)誘導(dǎo)愈傷率、愈傷組織形態(tài)學(xué)特征、分化及植株再生的影響。結(jié)果表明：2，4-D可誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，但愈傷組織誘導(dǎo)率極低；2，4-D和其他植物激素配合使用顯著提高了誘導(dǎo)率，在2mg/L2，4-D、1mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN的條件下可獲得較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，為56.3%。繼代培養(yǎng)基中添加激素濃度為誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的一半可獲得較好的增生的胚性愈傷組織，形態(tài)學(xué)特征為淡黃色，比較致密、較硬、呈顆粒狀結(jié)構(gòu)，沒有褐化出現(xiàn)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的分化能力。再生培養(yǎng)中，MS培養(yǎng)基中添加0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN可獲得較高的分化率（達(dá)到75.5%）和再生率（33.3%），表明6-BA和Kn的配合使用顯著提高了分化率。

關(guān)鍵詞：秈稻；成熟胚；愈傷組織；再生植株

中圖分類號(hào)：S511.2+10.43文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0045-03

利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行遺傳改良是改善秈稻品質(zhì)、提高抵抗病蟲害能力、培育新品種的重要手段之一，而高效的再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化成功的先決條件。近年來，研究者從幼穗、幼胚、花藥等部位誘導(dǎo)出愈傷組織和再生植株，愈傷組織誘導(dǎo)率高、質(zhì)量好，被廣泛用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化、品種培育中[1]。但是，上述材料多受季節(jié)限制，取材不便，阻礙了水稻組織培養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展。從胚性愈傷中首先獲得再生植株的是在粳稻中[2]，在秈稻中由于受到許多因素的限制，比如品種具有倔強(qiáng)的對(duì)抗外來刺激的特性[3]和具有基因型專一性[4-5]，使從成熟胚中誘導(dǎo)胚性愈傷組織率和植株再生率很低，導(dǎo)致了秈稻遺傳轉(zhuǎn)化很困難。

秈稻KraDangNgah是泰國(guó)南部的當(dāng)?shù)仄贩N，因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高且具有特殊香味而深受人們喜歡，但容易遭受病蟲害的危害。到目前為止沒有關(guān)于秈稻KraDangNgah再生體系的研究報(bào)道。本研究為了建立KraDangNgah再生體系，為遺傳轉(zhuǎn)化打好基礎(chǔ)，以成熟胚作為試驗(yàn)材料，對(duì)其在不同激素及濃度配比條件下的出愈率、愈傷組織狀態(tài)及再生率進(jìn)行研究，以期獲得狀態(tài)較好的愈傷組織，建立高效的再生體系。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及種子滅菌

秈稻KraDangNgah（OryzasativaL.）種子由泰國(guó)宋卡王子大學(xué)自然資源學(xué)院提供。健康成熟的種子剝?nèi)ネ鈿ず蠼?0%乙醇中1min進(jìn)行表面消毒，然后放入20%次氯酸鈉溶液中，滴入2～3滴Tween205min；最后在超凈工作臺(tái)中用無菌蒸餾水洗4～5次；再將種子放在無菌濾紙上吸干水分，備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1愈傷組織的誘導(dǎo)

滅菌的種子接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，即MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.75%瓊脂糖+1～4mg/L2，4-D，pH值調(diào)節(jié)到5.7。愈傷組織誘導(dǎo)在25～27℃、16h光照條件下培養(yǎng)30d后，調(diào)查誘導(dǎo)率及愈傷組織的狀態(tài)，愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的種子數(shù)/接種的種子數(shù)×100%。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)率的提高及優(yōu)化

為了提高愈傷組織誘導(dǎo)率和質(zhì)量，將滅菌種子接種到經(jīng)“1.2.1”節(jié)試驗(yàn)篩選出的較好的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，同時(shí)加入其他激素[（1）1mg/L2，4-D+1.5mg/LTDZ；（2）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA；（3）2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（4）2mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（5）4mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN；（6）4mg/L2，4-D+1.0mg/LIAA+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LKN]和1g/L水解酪蛋白（CH），愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件如“1.2.1”節(jié)所述。經(jīng)過30d培養(yǎng)后調(diào)查愈傷組織的大小、形態(tài)和誘導(dǎo)率，然后轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基中。

1.2.3愈傷組織的繼代培養(yǎng)

為了選取質(zhì)量好的胚性愈傷組織，將從成熟胚中誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加激素及濃度配比與愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同或減半的MS培養(yǎng)基中，所有繼代培養(yǎng)基中添加1g/LCH。培養(yǎng)30d后記錄胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率和褐化率，并在立體顯微鏡下鑒別胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，然后轉(zhuǎn)接到再生培養(yǎng)基中。

1.2.4植株再生培養(yǎng)

選取好的胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)接到添加不同細(xì)胞分裂素及濃度配比的MS培養(yǎng)基中，30d后調(diào)查再生情況。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Execl和DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率和分化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.12，4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

滅菌的水稻種子接種到含1～4mg/L2，4-D的MS培養(yǎng)上培養(yǎng)7d后，種子開始膨脹，逐漸開始出現(xiàn)白色愈傷。30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織情況見表1。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中不添加2，4-D時(shí)，沒有愈傷組織形成；當(dāng)2，4-D的濃度從1mg/L增加到3mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率從20.0%提高到33.9%，且愈傷組織的形態(tài)也隨之變化，從緊密黃褐色、緊密黃色到顆粒狀微黃色；當(dāng)2，4-D的濃度增加到4mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率又降低到31.2%，且形態(tài)變?yōu)辄S色松散狀，有的黏液化（圖1），說明高濃度的2，4-D抑制愈傷組織的形成。本試驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)使用2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率很低，不適宜秈稻KraDongNgah愈傷組織的誘導(dǎo)。

2.2NAA、6-BA、KN和TDZ對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

滅菌的種子接種到添加不同種類激素和濃度配比的MS培養(yǎng)基上后，3～4d后就開始膨脹，7d后愈傷組織形成，這些愈傷組織隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)不斷增生，30d后調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率和形態(tài)，結(jié)果（表2）表明，培養(yǎng)基中加NAA、6-BA、KN可以顯著提高誘導(dǎo)率，最高可以達(dá)到56.3%；此外還可以改進(jìn)愈傷組織質(zhì)量。從外形上看，這些愈傷組織量大、比較致密、較硬，呈顆粒狀結(jié)構(gòu)較多，易于分化，在立體顯微鏡下觀察呈胚性愈傷組織（圖2、圖3）。而在只有2，4-D的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織比較松軟，有的黏液化，有的有水泡，一般不易于分化（圖1）。當(dāng)在MS培養(yǎng)基中加入1mg/L2，4-D和1.5mg/LTDZ時(shí)，形成極少的愈傷組織（誘導(dǎo)率23.3%），其形態(tài)特征為緊密、硬且為白色，與其他激素濃度配比誘導(dǎo)愈傷組織較難增生。因此，2，4-D和NAA這2種細(xì)胞分裂素結(jié)合6-BA和KN2種生長(zhǎng)素可以獲得最高的愈傷組織誘導(dǎo)率和最好質(zhì)量的愈傷組織，比單獨(dú)使用2，4-D更能有效提高愈傷組織誘導(dǎo)率。

當(dāng)MS培養(yǎng)基中加入2mg/L2，4-D和其他生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素時(shí)，形成大量的愈傷組織，形態(tài)學(xué)特征為致密、呈白色、帶有一些綠點(diǎn)，這些綠點(diǎn)最終發(fā)育成芽，經(jīng)過立體顯微鏡觀察為胚性愈傷組織（圖2）；當(dāng)MS培養(yǎng)基中加入4mg/L2，4-D和其他生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素時(shí)，誘導(dǎo)的愈傷組織形態(tài)學(xué)特征為有些緊密、顏色從黃到白、比較小且有些褐化，只有少數(shù)的愈傷組織發(fā)展成胚性（圖3）。進(jìn)一步證明，2mg/L2，4-D配合其他植物激素更適合愈傷組織的誘導(dǎo)。因此MS+2mg/L2，4-D+1mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKN是最好的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

2.3不同激素濃度及配比對(duì)胚性愈傷組織的影響

繼代培養(yǎng)3周后，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的褐化和胚性愈傷組織的發(fā)育影響很大。結(jié)果（表4）表明，愈傷組織轉(zhuǎn)接到只添加2，4-D的MS培養(yǎng)基上褐化很嚴(yán)重，隨著2，4-D濃度增加，褐化率從100%減少到0，但其胚性愈傷的增殖很慢，表現(xiàn)出分化越來越困難。培養(yǎng)基中添加1mg/L或2mg/L2，4-D配合其他激素，褐化率比單獨(dú)使用2，4-D低，為0～27.2%。當(dāng)培養(yǎng)基中添加1mg/L2，4-D、0.5mg/LNAA、0.25～0.50mg/L6-BA和0.25mg/LKN時(shí)，愈傷組織沒有褐化且出現(xiàn)更多綠芽（圖4），表明激素濃度減半更能促進(jìn)胚性愈傷組織的發(fā)育和分化。說明NAA、6-BA

和KN能有效抑制愈傷組織的褐化，促進(jìn)胚性愈傷發(fā)育，從而提高分化能力。因此，這種培養(yǎng)基最適宜于愈傷組織繼代和分化培養(yǎng)。

2.4不同配比的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素對(duì)植株再生的影響

當(dāng)胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到表5中激素配比的培養(yǎng)基后，其分化和再生情況如表5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他激素相比，TDZ可以加快胚性愈傷組織的分化，縮短再生時(shí)間，但分化率和再生率較低（圖4），分別為29.6%、21.5%。NAA、6-BA和KN配合使用顯著提高了分化率，達(dá)45.8%～75.5%，說明不同配比的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)植株再生有顯著影響，當(dāng)細(xì)胞分裂素高于生長(zhǎng)素時(shí)，促進(jìn)植株的再生。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN是最適宜愈傷組織分化和再生的激素配比。

3討論與結(jié)論

秈稻的組織培養(yǎng)因品種不同，培養(yǎng)條件差異較大[6]，愈傷組織的質(zhì)量是影響秈稻再生頻率的關(guān)鍵因素，而2，4-D濃度對(duì)愈傷組織的數(shù)量及質(zhì)量影響均較大。一般認(rèn)為水稻愈傷組織誘導(dǎo)必須在培養(yǎng)基中添加2，4-D，以提高內(nèi)源ABA的水平，促進(jìn)胚性能力表達(dá)[7]，但僅添加2，4-D往往出愈率較低，特別是秈稻。本研究結(jié)果也表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中僅使用2，4-D時(shí)，誘導(dǎo)率比較低，說明秈稻HomKraDong具有基因型專一性。相同的結(jié)果在2010年被Zuraida等報(bào)道[8]。

田文忠在提高秈稻愈傷組織誘導(dǎo)率的研究中指出，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基或繼代培養(yǎng)基中加入KN和NAA能顯著改善愈傷組織的質(zhì)量，提高分化率[9]。本研究證實(shí)了這一點(diǎn)，當(dāng)MS培養(yǎng)基中加入2，4-D配合NAA、6-BA和KN能夠顯著提高誘導(dǎo)率和改善愈傷組織的質(zhì)量，說明細(xì)胞分裂素KN和6-BA可以改善愈傷組織的質(zhì)量并促其分化。因此本研究以2mg/L2，4-D、1.0mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和0.5mg/LKN為最適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

Zuraida等對(duì)秈稻MR219的研究結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA均對(duì)秈稻的分化培養(yǎng)有極顯著的影響[8，10]。本研究在分化培養(yǎng)基中加入6-BA濃度在1.0～1.5mg/L時(shí)，能夠顯著提高分化率；NAA是一種生長(zhǎng)素，濃度過低則生長(zhǎng)緩慢，濃度過高則在基部產(chǎn)生大量的愈傷組織且分化率下降，當(dāng)NAA和KN配合使用時(shí)可以改進(jìn)愈傷組織質(zhì)量。因此，0.5mg/LNAA、1.0mg/L6-BA和2mg/LKN濃度配比適合秈稻幼苗分化。本研究初步建立起了秈稻Kra

DangNgah的再生體系，為遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

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