農桿菌介導的玉米愈傷組織遺傳轉化影響因子和植株再生條件

張瑩瑩+吳連成+張賽賽+安允權+崔新建+陳彥惠

摘要：以HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的幼胚誘導的胚性愈傷為轉化受體，利用農桿菌介導轉化的方法，將抗粗縮病RNA干擾基因導入玉米愈傷組織，并對影響轉化的因素進行研究，以優化遺傳轉化體系。結果表明：繼代3次的4種玉米材料的抗性愈傷率最高，且不同品種間存在差異，HiⅡ的抗性愈傷率最高，為31.25%，其次為HiⅡB（26.56%）、HiⅡA（24.45%），H99的抗性愈傷率最低，僅為10.26%；預培養6d的愈傷組織適于轉化，其中HiⅡ的抗性愈傷率最高，為27.70%；結果還表明，菌液濃度D600nm=0.5～0.6是最佳的轉化條件。通過優化后的條件對得到的抗性愈傷用除草劑進行篩選，HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織；標記基因為bar基因，通過PCR檢測分別得到5、2、2、1塊陽性愈傷組織，再進一步用bar基因試紙條檢測，分別得到4、1、2、1株陽性植株。

關鍵詞：農桿菌介導法；遺傳轉化；植株再生；抗性愈傷；bar基因

中圖分類號：Q943.2；S513.03文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0051-03

近年來，轉基因技術已經在農業生產領域獲得了極大的發展，利用轉基因技術可以將外源基因整合到基因組中，從而改良農作物的性狀。玉米是世界第三大糧食作物，廣泛應用于食品、化學、醫療衛生等領域，它的遺傳轉化研究一直備受關注。

目前玉米轉化的方法主要有基因槍法和農桿菌介導法。基因槍法花費成本比較大，轉入的片段拷貝數多；而農桿菌介導法方法比較簡單，且成本少、轉化效率比較高、插入片段的拷貝數比較少，同時遺傳比較穩定，因而被廣泛采用。自1988年Rhodes等第1次獲得完整的玉米轉基因植株[1]以來，玉米的遺傳轉化體系取得了很大的進步和發展，目前國外許多轉基因品種已經應用于農業生產領域，轉化方法也越來越成熟。近年來，國內的轉基因技術得到了重大的突破，黃璐等采用農桿菌侵染玉米單交種胚性愈傷組織成功，同時獲得再生植株[2-3]；王國英等通過侵染玉米幼胚并將其誘導成愈傷，成功將Bt基因導入玉米中[4]。

本研究利用農桿菌介導法，用抗粗縮病的RNA干擾基因轉化由HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料誘導出的胚性愈傷組織，以轉移粗縮病RNA干擾基因，結果得到了抗性愈傷組織并再生成苗。此外，試驗對影響轉化效率的部分因素進行了初步研究，優化了農桿菌轉化玉米的條件，提高了農桿菌介導法對HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的轉化效率，為今后培育抗病新品種打下基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

玉米材料HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99中由中國農業大學賴錦盛教授贈送，于2013年4月下旬至5月中旬分期播種于河南農業大學科教園區。載體為RNA干擾抗玉米粗縮病載體。

1.2試驗方法

取HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料授粉10d左右、大小為1～2mm的未成熟幼胚，盾片向上放置于基本培養基上進行誘導，每2周繼代1次，約45d后形成穩定的愈傷組織。分別用繼代3、4、5、6、7次的4種基因型玉米的愈傷組織進行侵染轉化，侵染后的愈傷組織經選擇培養基篩選2次，最后獲得抗性愈傷組織，計算抗性愈傷率。分別選取繼代3次，預培養2、5、6、8、10d的4種玉米材料愈傷進行侵染，通過3次抗性篩選后，計算抗性愈傷率。將預培養5d的愈傷組織分別用D600nm值為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液浸泡10min，通過3次抗性篩選后，計算抗性愈傷率。

1.3數據處理

試驗數據采用SPSS19.0和Excel2013軟件進行統計分析。

2結果與分析

2.1不同繼代次數對4種玉米材料抗性愈傷率的影響

分別將繼代3、4、5、6、7次的HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米幼胚誘導出來的愈傷組織用D600nm=0.5的農桿菌侵染，根據產生的抗性愈傷數作統計分析，詳見表1。

由表1看出，繼代3次的HiⅡ玉米對農桿菌最敏感，抗性愈傷組織率為31.25%；其次是HiⅡB，為26.56%；HiⅡA為24.45%，H99為10.26%。繼代7次的抗性愈傷率均低于繼代3、4、5、6次，其中H99的抗性愈傷率最低，僅為5.13%。

本試驗結果顯示：隨著繼代次數的增加，愈傷組織的轉化效率逐漸降低，繼代3次是農桿菌侵染的最佳時期。

2.2預培養時間對抗性愈傷轉化率的影響

分別選取繼代3次，預培養2、5、6、8、10d的愈傷進行侵染，通過3次抗性篩選后，其抗性愈傷率見表2。

由表2可以看出，侵染前愈傷組織的培養狀態對玉米轉化效率有很大的影響。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99這4種玉米材料都以繼代6d的抗性愈傷率最高，而繼代2d的抗性愈傷率最低。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99這4種玉米材料在新鮮繼代培養基中預培養2d的抗性愈傷率分別為9.00%、10.00%、9.55%、4.29%；預培養2～6d，抗性愈傷率呈直線上升趨勢，6d時達到最高值，4種材料以HiⅡ繼代6d時的愈傷組織轉化率最高，達到了27.70%，同期的HiⅡB、HiⅡA、H99分別為22.73%、21.43%、9.30%；6～10d時的抗性愈傷率有所降低，10d時最低，HiⅡ為15.94%，HiⅡB為12.38%，HiⅡA為11.91%，H99僅為4.76%。

2.3農桿菌濃度對抗性愈傷轉化率的影響

用D600nm值分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液侵染HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的愈傷組織10min，圖1結果顯示，農桿菌濃度在0.3～0.6之間時，轉化率隨著農桿菌濃度升高而增高，HiⅡ的轉化率從9.00%升高到33.33%，HiⅡB的轉化率從10.21%升高到23.62%，HiⅡA的轉化率從8.11%升高到20.31%，H99的轉化率從2.06%升高到7.35%；當農桿菌濃度大于0.6時，增加農桿菌的濃度，轉化率反而下降，發生這樣的結果可能是因為農桿菌濃度大時造成愈傷組織污染，使轉化效率降低。綜合比較可以看出，D600nm值為0.5～0.6是合適的濃度范圍。

2.4抗性愈傷組織標記基因bar的PCR檢測

在優化后的轉基因體系中加入除草劑進行篩選，得到22塊抗性愈傷組織，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織，再通過標記基因bar的PCR檢測分別得到5、2、2、1塊陽性愈傷組織，標記基因大小為600bp，陽性率分別為50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（圖2）。綜合比較可知，HiⅡ的陽性率相對較高。

2.5抗性愈傷再生植株的獲得及bar基因試紙條檢測

將PCR檢測得到的陽性愈傷進行進一步擴繁，一部分進行出苗試驗，另一部分進行保留，保留的目的是怕陽性愈傷在出苗過程中死亡。對于出苗的植株進行bar基因試紙條檢測，目的是從蛋白質水平上進一步檢測目的基因是否已經導入玉米基因組，結果從HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分別獲得4、1、2、1株陽性植株，其中HiⅡ的轉基因效果最好（圖3）。

2.6T0代轉化植株目的基因的PCR鑒定

對PCR檢測獲得的10株轉基因植株設計目的基因特異引物，經過PCR擴增出400bp的目的條帶，檢測到10株全為陽性植株（圖4）。結果表明外源基因已經整合到玉米基因組中。

3討論

對于農桿菌介導的玉米遺傳轉化，國內外報道大多數都是以幼胚作為遺傳轉化的受體[5]，但是幼胚的取材受時間影響很大，一旦錯過了最佳時期就很難使試驗繼續進行。而愈傷組織不受時間影響，可以長期作為轉化的受體，而且能長期繼代培養。

玉米材料的不同對遺傳轉化有很大的影響，有的材料能誘導出適合轉化的玉米材料，有的則不能。本試驗用農桿菌轉化繼代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈傷組織，結果表明：HiⅡ的抗性愈傷率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，這與George等的研究結果[6-7]一致，即不同的玉米品種接受農桿菌侵染的能力也不同，接受轉化的受體對品種的依賴性很強；基因型相同時，繼代3次的抗性愈傷率高于其他繼代次數，與余桂榮的試驗結果相同；侵染前預培養愈傷組織的轉化頻率高于未預培養的，且預培養6d的侵染效果較好，這與伍曉麗等的研究結果[8]相一致。產生這些結果的原因可能有以下幾點：（1）基因型方面，B73和A188是良好的轉基因受體材料，HiⅡB和HiⅡA是B73與A188雜交得到的衍生系，HiⅡB誘導的愈傷組織較HiⅡA松散，HiⅡA外殼相對比較硬，HiⅡ是由HiⅡB與HiⅡA雜交所得到的，具有兩者的綜合優點，為Ⅱ型愈傷組織，Ⅱ型愈傷的生長速度非常快，形狀類似菜花，結構松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈傷組織大多為I型，外殼比較硬，不太容易擴大培養，抗性愈傷率比較低。（2）在愈傷組織的整個生長期間，前3次的生長比較快，細胞增殖能力強，3次以后由于代謝物質的逐漸積累，篩選出的抗性愈傷較低，因而繼代3次的玉米愈傷組織侵染效率比較高。（3）侵染前預培養一段時間有利于愈傷的生理狀態達到良好的狀態，沒有預培養的愈傷在上次繼代到14d時，有可能會有少量的有毒物質產生，而預培養一段時間的愈傷組織代謝比較旺盛，適于農桿菌侵染。

農桿菌濃度對侵染效率也有很大的影響。農桿菌濃度過低時，吸附在細胞表面的農桿菌過少而不能有效地將T-DNA轉移到植物體內，濃度過大時容易使愈傷組織污染。本研究表明，當菌液濃度為D600nm=0.5～0.6時，HiⅡ愈傷組織的抗性愈傷組織誘導率達最高值。

本試驗通過優化后的轉基因體系對4種玉米材料的愈傷組織進行侵染，在篩選過程中選擇出抗性愈傷組織，取其抗性愈傷的一部分提取DNA，并對其進行PCR檢測，對檢測出來的抗性愈傷一分為二，一部分進行擴繁，另一部分進行再生出苗，再生出苗的植株進行bar基因試紙條的檢測，進一步從蛋白質水平上對轉基因結果進行檢測，優化后的轉基因體系極大地提高了轉基因的轉化率。

參考文獻：

[1]RhodesCA，PierceDA，MettlerIJ，etal.Geneticallytransformedmaizeplantsfromprotoplasts[J].Science，1988，240（4849）：204-207.

[2]黃璐，衛志明.農桿菌介導的玉米遺傳轉化[J].實驗生物學報，1999，32（4）：381-389.

[3]張榮，王國英，張曉紅，等.根癌農桿菌介導的玉米遺傳轉化體系的建立[J].農業生物技術學報，2001，9（1）：45-48.

[4]王國英，張宏，謝友菊，等.玉米胚性愈傷組織轉化及轉Bt基因植株的抗蟲性[J].農業生物技術學報，1995（3）：49-53.

[5]ZhaoZY，GuW，CaiT.MethodsforAgrobacterium-mediatedtransformation：UnitedStates，6822144[P].1999：598-840.

[6]GeorgeL，EapenS.Highfrequencyplant-regenerationthroughdirectshootdevelopmentandsomaticembryogenesisfromimmatureinflorescenceculturesoffingermillet（EleusinecoracanaGaertn）[J].Euphytica，1990，48（3）：269-274.

[7]MythiliPK，MadhaviA，ReddyVD，etal.Efficientregenerationofpearlmillet[Pennisetumglaucum（L.）R.Br.]fromshoottipcultures[J].IndianJournalofExperimentalBiology，2001，39（12）：1274-1279.

[8]伍曉麗，朱禎，李晚忱，等.農桿菌介導豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（cpti）在玉米中的遺傳轉化[J].作物學報，2004（3）：297-298.

[9]季良越，孫曉麗，韋小敏，等.玉米胚性愈傷組織誘導和植株再生研究[J].河南農業大學學報，2002，36（2）：101-105.

2.4抗性愈傷組織標記基因bar的PCR檢測

在優化后的轉基因體系中加入除草劑進行篩選，得到22塊抗性愈傷組織，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織，再通過標記基因bar的PCR檢測分別得到5、2、2、1塊陽性愈傷組織，標記基因大小為600bp，陽性率分別為50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（圖2）。綜合比較可知，HiⅡ的陽性率相對較高。

2.5抗性愈傷再生植株的獲得及bar基因試紙條檢測

將PCR檢測得到的陽性愈傷進行進一步擴繁，一部分進行出苗試驗，另一部分進行保留，保留的目的是怕陽性愈傷在出苗過程中死亡。對于出苗的植株進行bar基因試紙條檢測，目的是從蛋白質水平上進一步檢測目的基因是否已經導入玉米基因組，結果從HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分別獲得4、1、2、1株陽性植株，其中HiⅡ的轉基因效果最好（圖3）。

2.6T0代轉化植株目的基因的PCR鑒定

對PCR檢測獲得的10株轉基因植株設計目的基因特異引物，經過PCR擴增出400bp的目的條帶，檢測到10株全為陽性植株（圖4）。結果表明外源基因已經整合到玉米基因組中。

3討論

對于農桿菌介導的玉米遺傳轉化，國內外報道大多數都是以幼胚作為遺傳轉化的受體[5]，但是幼胚的取材受時間影響很大，一旦錯過了最佳時期就很難使試驗繼續進行。而愈傷組織不受時間影響，可以長期作為轉化的受體，而且能長期繼代培養。

玉米材料的不同對遺傳轉化有很大的影響，有的材料能誘導出適合轉化的玉米材料，有的則不能。本試驗用農桿菌轉化繼代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈傷組織，結果表明：HiⅡ的抗性愈傷率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，這與George等的研究結果[6-7]一致，即不同的玉米品種接受農桿菌侵染的能力也不同，接受轉化的受體對品種的依賴性很強；基因型相同時，繼代3次的抗性愈傷率高于其他繼代次數，與余桂榮的試驗結果相同；侵染前預培養愈傷組織的轉化頻率高于未預培養的，且預培養6d的侵染效果較好，這與伍曉麗等的研究結果[8]相一致。產生這些結果的原因可能有以下幾點：（1）基因型方面，B73和A188是良好的轉基因受體材料，HiⅡB和HiⅡA是B73與A188雜交得到的衍生系，HiⅡB誘導的愈傷組織較HiⅡA松散，HiⅡA外殼相對比較硬，HiⅡ是由HiⅡB與HiⅡA雜交所得到的，具有兩者的綜合優點，為Ⅱ型愈傷組織，Ⅱ型愈傷的生長速度非常快，形狀類似菜花，結構松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈傷組織大多為I型，外殼比較硬，不太容易擴大培養，抗性愈傷率比較低。（2）在愈傷組織的整個生長期間，前3次的生長比較快，細胞增殖能力強，3次以后由于代謝物質的逐漸積累，篩選出的抗性愈傷較低，因而繼代3次的玉米愈傷組織侵染效率比較高。（3）侵染前預培養一段時間有利于愈傷的生理狀態達到良好的狀態，沒有預培養的愈傷在上次繼代到14d時，有可能會有少量的有毒物質產生，而預培養一段時間的愈傷組織代謝比較旺盛，適于農桿菌侵染。

農桿菌濃度對侵染效率也有很大的影響。農桿菌濃度過低時，吸附在細胞表面的農桿菌過少而不能有效地將T-DNA轉移到植物體內，濃度過大時容易使愈傷組織污染。本研究表明，當菌液濃度為D600nm=0.5～0.6時，HiⅡ愈傷組織的抗性愈傷組織誘導率達最高值。

本試驗通過優化后的轉基因體系對4種玉米材料的愈傷組織進行侵染，在篩選過程中選擇出抗性愈傷組織，取其抗性愈傷的一部分提取DNA，并對其進行PCR檢測，對檢測出來的抗性愈傷一分為二，一部分進行擴繁，另一部分進行再生出苗，再生出苗的植株進行bar基因試紙條的檢測，進一步從蛋白質水平上對轉基因結果進行檢測，優化后的轉基因體系極大地提高了轉基因的轉化率。

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[9]季良越，孫曉麗，韋小敏，等.玉米胚性愈傷組織誘導和植株再生研究[J].河南農業大學學報，2002，36（2）：101-105.

2.4抗性愈傷組織標記基因bar的PCR檢測

在優化后的轉基因體系中加入除草劑進行篩選，得到22塊抗性愈傷組織，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織，再通過標記基因bar的PCR檢測分別得到5、2、2、1塊陽性愈傷組織，標記基因大小為600bp，陽性率分別為50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（圖2）。綜合比較可知，HiⅡ的陽性率相對較高。

2.5抗性愈傷再生植株的獲得及bar基因試紙條檢測

將PCR檢測得到的陽性愈傷進行進一步擴繁，一部分進行出苗試驗，另一部分進行保留，保留的目的是怕陽性愈傷在出苗過程中死亡。對于出苗的植株進行bar基因試紙條檢測，目的是從蛋白質水平上進一步檢測目的基因是否已經導入玉米基因組，結果從HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分別獲得4、1、2、1株陽性植株，其中HiⅡ的轉基因效果最好（圖3）。

2.6T0代轉化植株目的基因的PCR鑒定

對PCR檢測獲得的10株轉基因植株設計目的基因特異引物，經過PCR擴增出400bp的目的條帶，檢測到10株全為陽性植株（圖4）。結果表明外源基因已經整合到玉米基因組中。

3討論

對于農桿菌介導的玉米遺傳轉化，國內外報道大多數都是以幼胚作為遺傳轉化的受體[5]，但是幼胚的取材受時間影響很大，一旦錯過了最佳時期就很難使試驗繼續進行。而愈傷組織不受時間影響，可以長期作為轉化的受體，而且能長期繼代培養。

玉米材料的不同對遺傳轉化有很大的影響，有的材料能誘導出適合轉化的玉米材料，有的則不能。本試驗用農桿菌轉化繼代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈傷組織，結果表明：HiⅡ的抗性愈傷率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，這與George等的研究結果[6-7]一致，即不同的玉米品種接受農桿菌侵染的能力也不同，接受轉化的受體對品種的依賴性很強；基因型相同時，繼代3次的抗性愈傷率高于其他繼代次數，與余桂榮的試驗結果相同；侵染前預培養愈傷組織的轉化頻率高于未預培養的，且預培養6d的侵染效果較好，這與伍曉麗等的研究結果[8]相一致。產生這些結果的原因可能有以下幾點：（1）基因型方面，B73和A188是良好的轉基因受體材料，HiⅡB和HiⅡA是B73與A188雜交得到的衍生系，HiⅡB誘導的愈傷組織較HiⅡA松散，HiⅡA外殼相對比較硬，HiⅡ是由HiⅡB與HiⅡA雜交所得到的，具有兩者的綜合優點，為Ⅱ型愈傷組織，Ⅱ型愈傷的生長速度非常快，形狀類似菜花，結構松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈傷組織大多為I型，外殼比較硬，不太容易擴大培養，抗性愈傷率比較低。（2）在愈傷組織的整個生長期間，前3次的生長比較快，細胞增殖能力強，3次以后由于代謝物質的逐漸積累，篩選出的抗性愈傷較低，因而繼代3次的玉米愈傷組織侵染效率比較高。（3）侵染前預培養一段時間有利于愈傷的生理狀態達到良好的狀態，沒有預培養的愈傷在上次繼代到14d時，有可能會有少量的有毒物質產生，而預培養一段時間的愈傷組織代謝比較旺盛，適于農桿菌侵染。

農桿菌濃度對侵染效率也有很大的影響。農桿菌濃度過低時，吸附在細胞表面的農桿菌過少而不能有效地將T-DNA轉移到植物體內，濃度過大時容易使愈傷組織污染。本研究表明，當菌液濃度為D600nm=0.5～0.6時，HiⅡ愈傷組織的抗性愈傷組織誘導率達最高值。

本試驗通過優化后的轉基因體系對4種玉米材料的愈傷組織進行侵染，在篩選過程中選擇出抗性愈傷組織，取其抗性愈傷的一部分提取DNA，并對其進行PCR檢測，對檢測出來的抗性愈傷一分為二，一部分進行擴繁，另一部分進行再生出苗，再生出苗的植株進行bar基因試紙條的檢測，進一步從蛋白質水平上對轉基因結果進行檢測，優化后的轉基因體系極大地提高了轉基因的轉化率。

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[7]MythiliPK，MadhaviA，ReddyVD，etal.Efficientregenerationofpearlmillet[Pennisetumglaucum（L.）R.Br.]fromshoottipcultures[J].IndianJournalofExperimentalBiology，2001，39（12）：1274-1279.

[8]伍曉麗，朱禎，李晚忱，等.農桿菌介導豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（cpti）在玉米中的遺傳轉化[J].作物學報，2004（3）：297-298.

[9]季良越，孫曉麗，韋小敏，等.玉米胚性愈傷組織誘導和植株再生研究[J].河南農業大學學報，2002，36（2）：101-105.