木薯組織培養(yǎng)外植體選擇和滅菌研究

岑湘濤+沈偉+楊美純+農(nóng)艷豐+蘇小茴

摘要：以木薯品種華南205為材料，研究外植體類型與不同滅菌方法對(duì)其組織培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：9—10月份室外取材滅菌效果最理想，HgCl2滅菌處理7—8月份取的外植體的時(shí)間需控制在10min內(nèi)，而滅菌處理9—10月份取的外植體的時(shí)間需控制在5min。此外，室內(nèi)水培木薯莖段和室外莖段的中部均可作為組織培養(yǎng)的良好材料。

關(guān)鍵詞：木薯；外植體；組織培養(yǎng)；滅菌

中圖分類號(hào)：S533.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0071-02

木薯（ManihotesculentaCrantz）別稱樹(shù)木薯、樹(shù)番薯，大戟科木薯屬，是世界3大薯類作物（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一。木薯耐貧瘠、耐干旱、抗性強(qiáng)，單位面積產(chǎn)量高，淀粉產(chǎn)出量高，素有“地下糧倉(cāng)”、“淀粉之王”和“能源作物”之美譽(yù)[1]。目前木薯主要用途是食用、飼用和在工業(yè)上的開(kāi)發(fā)利用。其中90%以上的木薯主要用于淀粉和變性淀粉的生產(chǎn)。近年來(lái)用木薯作為能源植物生產(chǎn)燃料乙醇，使得國(guó)家可再生能源法將木薯列為發(fā)展生物質(zhì)能源的少數(shù)幾種植物之一，能源木薯產(chǎn)業(yè)顯示出極大的發(fā)展?jié)摿2]。

廣西是我國(guó)最大的木薯種植省區(qū)，其木薯乙醇產(chǎn)量、變性淀粉、山梨醇等產(chǎn)量均居全國(guó)前列，木薯及其產(chǎn)品群總值也位居全國(guó)之首[3]。目前生產(chǎn)上木薯多采用成熟的莖段進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，這種方式繁殖率低，導(dǎo)致良種推廣速度慢。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)木薯進(jìn)行快速繁殖，將是加速木薯良種大面積推廣的有效途徑[4-6]。在木薯組織培養(yǎng)中，選擇適合的外植體，是其組織培養(yǎng)能否成功的一個(gè)關(guān)鍵。此外，木薯外植體表面和內(nèi)部常攜帶一些微生物，是組織培養(yǎng)過(guò)程的主要污染源，解決外植體污染是木薯組織培養(yǎng)能否成功的另一個(gè)關(guān)鍵。因此，在本研究中，針對(duì)木薯組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題，將重點(diǎn)研究外植體類型和滅菌方法對(duì)其組織培養(yǎng)效果的影響，以期為木薯組培快繁提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試品種為華南205的室外莖段和水培莖段，室外采樣地點(diǎn)為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院大田。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1室外莖段取材和滅菌

取樣時(shí)間與滅菌過(guò)程：分別于5—6月、7—8月、9—10月在田間選取木薯健康植株上帶芽的莖段作為外植體。將莖段從葉柄基部切除葉片，用洗衣粉溶液浸泡10～15min，再用自來(lái)水沖洗10～15min，然后將莖段切成帶1～2個(gè)芽、長(zhǎng)約1.5cm的小段，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面滅菌，方法如下：75%乙醇漂洗20s后，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2溶液中，滅菌時(shí)間設(shè)5、7、10min3個(gè)處理。滅菌期間不斷搖動(dòng)，使外植體與滅菌劑充分接觸。經(jīng)上述滅菌處理后無(wú)菌水沖洗5～6次，接種到MS培養(yǎng)基中。

外植體類型：將帶芽莖段分為3個(gè)部分，頂芽以下第1～2個(gè)芽為上部；第3～6個(gè)芽為中部；第7個(gè)芽以下為下部。按照上述方法對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理后，用75%乙醇進(jìn)行表面滅菌20s，無(wú)菌水沖洗1次，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2的溶液中滅菌5min，最后用無(wú)菌水沖洗5～6次，接種到MS培養(yǎng)基中。

1.2.2水培莖段取材與滅菌

田間采集的莖段經(jīng)剪截處理后，將莖段基部浸入清水中5cm左右，2d換水1次，4d修剪枝條基部截面1次，并小心刷凈枝條基部污垢，以防導(dǎo)管堵塞，影響水分吸收。待水培芽長(zhǎng)至15cm左右時(shí)剪下作為接種外植體。滅菌方法如下：0.1%HgCl2滅菌4、5、6min，然后無(wú)菌水沖洗5～6次，之后接種到MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)天后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

1.2.3培養(yǎng)條件

接種后的材料均在25±5℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天以1600～2000lx的光照強(qiáng)度照射約10h。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以上試驗(yàn)均于1周內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。污染率=污染株數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；成活率=成活數(shù)/（外植體總數(shù)-污染數(shù)-死亡數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1取樣和滅菌時(shí)間對(duì)外植體培養(yǎng)的影響

從表1可知，取樣時(shí)間和滅菌時(shí)間共同影響外植體培養(yǎng)效果，其中5—6月污染控制難度大，3個(gè)滅菌處理控制污染的效果均不理想，污染率最高達(dá)到100%；7—8月污染控制較為容易，隨著滅菌時(shí)間的增加，污染率從66.7%降到44.1%；9—10月份污染控制效果最理想，污染率最低為35.0%。為將污染率和死亡率控制到最低，不同取樣時(shí)期需要不同的HgCl2處理時(shí)間，其中7—8月份取樣時(shí)HgCl2處理時(shí)間需控制在10min內(nèi)，9—10月份取樣時(shí)HgCl2處理時(shí)間需控制在5min。

2.2外植體部位對(duì)其組織培養(yǎng)效果的影響

從表2可看出，外植體部位對(duì)其組織培養(yǎng)效果影響很大，其中靠近頂芽的莖段太幼嫩，雖然污染少，但由于組織太幼嫩，很容易被乙醇和HgCl2損傷，所以接種后大部分莖段褐化死亡，因此不適合作為組織培養(yǎng)的外植體；第7位及以下的芽位莖段中大部分是海綿狀的髓部，很難徹底消毒，所以也不適合作為外植體；而頂芽以下第3～6個(gè)芽較幼嫩，成活率相對(duì)較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

2.3滅菌時(shí)間對(duì)水培外植體組織培養(yǎng)效果的影響

由于水培的木薯莖段組織幼嫩，因此不采用乙醇和HgCl2結(jié)合的滅菌方法。單獨(dú)使用0.1%HgCl2溶液處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率降低，但其成活率也相應(yīng)降低，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到6min時(shí)，成活率為70.0%（表3）。綜合比較，0.1%HgCl2處理5min是水培芽最適宜的滅菌方法。

3結(jié)論與討論

外植體選擇是影響組培微繁效果的一個(gè)非常重要的因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同來(lái)源的外植體污染率存在很大差異，用水培方法獲得的外植體污染率低、存活率高，而室外莖段由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在田間，菌類孳生，作外植體時(shí)，污染率較高。盡管水培莖段培養(yǎng)具有污染率低、存活率高等優(yōu)點(diǎn)，但水培莖段受時(shí)間條件制約，同時(shí)水培時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)自身儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗而影響外植體質(zhì)量。對(duì)于組織培養(yǎng)工廠化育苗來(lái)說(shuō)，要求年繁殖數(shù)達(dá)到百萬(wàn)株或者更多，用水培莖段做外植體則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求。因此，將2種外植體同時(shí)用于實(shí)踐，在各個(gè)時(shí)期相互補(bǔ)充，才能不斷滿足木薯種苗周年生產(chǎn)的要求。在用室外莖段做外植體時(shí)，外植體選取的時(shí)期、部位對(duì)污染的影響都至關(guān)重要[7]。應(yīng)根據(jù)取材時(shí)間外植體污染控制的難易程度，充分考慮污染因素，調(diào)整滅菌方案。植物組織培養(yǎng)中外植體種類的選擇以污染少、易啟動(dòng)為原則[8-9]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)外植體部位對(duì)組織培養(yǎng)效果影響的研究，發(fā)現(xiàn)木薯頂芽以下第3～6個(gè)芽較幼嫩，成活率相對(duì)較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

參考文獻(xiàn)：

[1]甘騫.木薯的種植與利用[J].云南農(nóng)業(yè)科技，1996（5）：28-30.

[2]王建梅.木薯將成發(fā)展生物能源的生力軍[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)信息，2006（12）：12-13.

[3]木薯淀粉酒精網(wǎng).廣西木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展引起國(guó)內(nèi)外專家熱議[EB/OL].（2009-03-06）[2014-09-05].http：//www.vnsugar.com.

[4]覃艷，陳宇.木薯組織培養(yǎng)快速繁殖的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，38（1）：35-37.

[5]李斌，黃永才，覃劍鋒，等.木薯優(yōu)良品種“華南124”的組織培養(yǎng)[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2008（4）：9-11.

[6]何承光.木薯良種GR891組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（5）：471-474.

[7]陳正華.木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用[M].北京：高等教育出版社，1986.

[8]曹孜義，劉國(guó)民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

[9]潘瑞熾.植物組織培養(yǎng)[M].廣州：廣東高等教育出版社，2000.

摘要：以木薯品種華南205為材料，研究外植體類型與不同滅菌方法對(duì)其組織培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：9—10月份室外取材滅菌效果最理想，HgCl2滅菌處理7—8月份取的外植體的時(shí)間需控制在10min內(nèi)，而滅菌處理9—10月份取的外植體的時(shí)間需控制在5min。此外，室內(nèi)水培木薯莖段和室外莖段的中部均可作為組織培養(yǎng)的良好材料。

關(guān)鍵詞：木薯；外植體；組織培養(yǎng)；滅菌

中圖分類號(hào)：S533.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0071-02

木薯（ManihotesculentaCrantz）別稱樹(shù)木薯、樹(shù)番薯，大戟科木薯屬，是世界3大薯類作物（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一。木薯耐貧瘠、耐干旱、抗性強(qiáng)，單位面積產(chǎn)量高，淀粉產(chǎn)出量高，素有“地下糧倉(cāng)”、“淀粉之王”和“能源作物”之美譽(yù)[1]。目前木薯主要用途是食用、飼用和在工業(yè)上的開(kāi)發(fā)利用。其中90%以上的木薯主要用于淀粉和變性淀粉的生產(chǎn)。近年來(lái)用木薯作為能源植物生產(chǎn)燃料乙醇，使得國(guó)家可再生能源法將木薯列為發(fā)展生物質(zhì)能源的少數(shù)幾種植物之一，能源木薯產(chǎn)業(yè)顯示出極大的發(fā)展?jié)摿2]。

廣西是我國(guó)最大的木薯種植省區(qū)，其木薯乙醇產(chǎn)量、變性淀粉、山梨醇等產(chǎn)量均居全國(guó)前列，木薯及其產(chǎn)品群總值也位居全國(guó)之首[3]。目前生產(chǎn)上木薯多采用成熟的莖段進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，這種方式繁殖率低，導(dǎo)致良種推廣速度慢。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)木薯進(jìn)行快速繁殖，將是加速木薯良種大面積推廣的有效途徑[4-6]。在木薯組織培養(yǎng)中，選擇適合的外植體，是其組織培養(yǎng)能否成功的一個(gè)關(guān)鍵。此外，木薯外植體表面和內(nèi)部常攜帶一些微生物，是組織培養(yǎng)過(guò)程的主要污染源，解決外植體污染是木薯組織培養(yǎng)能否成功的另一個(gè)關(guān)鍵。因此，在本研究中，針對(duì)木薯組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題，將重點(diǎn)研究外植體類型和滅菌方法對(duì)其組織培養(yǎng)效果的影響，以期為木薯組培快繁提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試品種為華南205的室外莖段和水培莖段，室外采樣地點(diǎn)為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院大田。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1室外莖段取材和滅菌

取樣時(shí)間與滅菌過(guò)程：分別于5—6月、7—8月、9—10月在田間選取木薯健康植株上帶芽的莖段作為外植體。將莖段從葉柄基部切除葉片，用洗衣粉溶液浸泡10～15min，再用自來(lái)水沖洗10～15min，然后將莖段切成帶1～2個(gè)芽、長(zhǎng)約1.5cm的小段，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面滅菌，方法如下：75%乙醇漂洗20s后，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2溶液中，滅菌時(shí)間設(shè)5、7、10min3個(gè)處理。滅菌期間不斷搖動(dòng)，使外植體與滅菌劑充分接觸。經(jīng)上述滅菌處理后無(wú)菌水沖洗5～6次，接種到MS培養(yǎng)基中。

外植體類型：將帶芽莖段分為3個(gè)部分，頂芽以下第1～2個(gè)芽為上部；第3～6個(gè)芽為中部；第7個(gè)芽以下為下部。按照上述方法對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理后，用75%乙醇進(jìn)行表面滅菌20s，無(wú)菌水沖洗1次，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2的溶液中滅菌5min，最后用無(wú)菌水沖洗5～6次，接種到MS培養(yǎng)基中。

1.2.2水培莖段取材與滅菌

田間采集的莖段經(jīng)剪截處理后，將莖段基部浸入清水中5cm左右，2d換水1次，4d修剪枝條基部截面1次，并小心刷凈枝條基部污垢，以防導(dǎo)管堵塞，影響水分吸收。待水培芽長(zhǎng)至15cm左右時(shí)剪下作為接種外植體。滅菌方法如下：0.1%HgCl2滅菌4、5、6min，然后無(wú)菌水沖洗5～6次，之后接種到MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)天后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

1.2.3培養(yǎng)條件

接種后的材料均在25±5℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天以1600～2000lx的光照強(qiáng)度照射約10h。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以上試驗(yàn)均于1周內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。污染率=污染株數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；成活率=成活數(shù)/（外植體總數(shù)-污染數(shù)-死亡數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1取樣和滅菌時(shí)間對(duì)外植體培養(yǎng)的影響

從表1可知，取樣時(shí)間和滅菌時(shí)間共同影響外植體培養(yǎng)效果，其中5—6月污染控制難度大，3個(gè)滅菌處理控制污染的效果均不理想，污染率最高達(dá)到100%；7—8月污染控制較為容易，隨著滅菌時(shí)間的增加，污染率從66.7%降到44.1%；9—10月份污染控制效果最理想，污染率最低為35.0%。為將污染率和死亡率控制到最低，不同取樣時(shí)期需要不同的HgCl2處理時(shí)間，其中7—8月份取樣時(shí)HgCl2處理時(shí)間需控制在10min內(nèi)，9—10月份取樣時(shí)HgCl2處理時(shí)間需控制在5min。

2.2外植體部位對(duì)其組織培養(yǎng)效果的影響

從表2可看出，外植體部位對(duì)其組織培養(yǎng)效果影響很大，其中靠近頂芽的莖段太幼嫩，雖然污染少，但由于組織太幼嫩，很容易被乙醇和HgCl2損傷，所以接種后大部分莖段褐化死亡，因此不適合作為組織培養(yǎng)的外植體；第7位及以下的芽位莖段中大部分是海綿狀的髓部，很難徹底消毒，所以也不適合作為外植體；而頂芽以下第3～6個(gè)芽較幼嫩，成活率相對(duì)較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

2.3滅菌時(shí)間對(duì)水培外植體組織培養(yǎng)效果的影響

由于水培的木薯莖段組織幼嫩，因此不采用乙醇和HgCl2結(jié)合的滅菌方法。單獨(dú)使用0.1%HgCl2溶液處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率降低，但其成活率也相應(yīng)降低，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到6min時(shí)，成活率為70.0%（表3）。綜合比較，0.1%HgCl2處理5min是水培芽最適宜的滅菌方法。

3結(jié)論與討論

外植體選擇是影響組培微繁效果的一個(gè)非常重要的因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同來(lái)源的外植體污染率存在很大差異，用水培方法獲得的外植體污染率低、存活率高，而室外莖段由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在田間，菌類孳生，作外植體時(shí)，污染率較高。盡管水培莖段培養(yǎng)具有污染率低、存活率高等優(yōu)點(diǎn)，但水培莖段受時(shí)間條件制約，同時(shí)水培時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)自身儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗而影響外植體質(zhì)量。對(duì)于組織培養(yǎng)工廠化育苗來(lái)說(shuō)，要求年繁殖數(shù)達(dá)到百萬(wàn)株或者更多，用水培莖段做外植體則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求。因此，將2種外植體同時(shí)用于實(shí)踐，在各個(gè)時(shí)期相互補(bǔ)充，才能不斷滿足木薯種苗周年生產(chǎn)的要求。在用室外莖段做外植體時(shí)，外植體選取的時(shí)期、部位對(duì)污染的影響都至關(guān)重要[7]。應(yīng)根據(jù)取材時(shí)間外植體污染控制的難易程度，充分考慮污染因素，調(diào)整滅菌方案。植物組織培養(yǎng)中外植體種類的選擇以污染少、易啟動(dòng)為原則[8-9]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)外植體部位對(duì)組織培養(yǎng)效果影響的研究，發(fā)現(xiàn)木薯頂芽以下第3～6個(gè)芽較幼嫩，成活率相對(duì)較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

參考文獻(xiàn)：

[1]甘騫.木薯的種植與利用[J].云南農(nóng)業(yè)科技，1996（5）：28-30.

[2]王建梅.木薯將成發(fā)展生物能源的生力軍[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)信息，2006（12）：12-13.

[3]木薯淀粉酒精網(wǎng).廣西木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展引起國(guó)內(nèi)外專家熱議[EB/OL].（2009-03-06）[2014-09-05].http：//www.vnsugar.com.

[4]覃艷，陳宇.木薯組織培養(yǎng)快速繁殖的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，38（1）：35-37.

[5]李斌，黃永才，覃劍鋒，等.木薯優(yōu)良品種“華南124”的組織培養(yǎng)[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2008（4）：9-11.

[6]何承光.木薯良種GR891組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（5）：471-474.

[7]陳正華.木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用[M].北京：高等教育出版社，1986.

[8]曹孜義，劉國(guó)民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

[9]潘瑞熾.植物組織培養(yǎng)[M].廣州：廣東高等教育出版社，2000.

摘要：以木薯品種華南205為材料，研究外植體類型與不同滅菌方法對(duì)其組織培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：9—10月份室外取材滅菌效果最理想，HgCl2滅菌處理7—8月份取的外植體的時(shí)間需控制在10min內(nèi)，而滅菌處理9—10月份取的外植體的時(shí)間需控制在5min。此外，室內(nèi)水培木薯莖段和室外莖段的中部均可作為組織培養(yǎng)的良好材料。

關(guān)鍵詞：木薯；外植體；組織培養(yǎng)；滅菌

中圖分類號(hào)：S533.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0071-02

木薯（ManihotesculentaCrantz）別稱樹(shù)木薯、樹(shù)番薯，大戟科木薯屬，是世界3大薯類作物（馬鈴薯、甘薯、木薯）之一。木薯耐貧瘠、耐干旱、抗性強(qiáng)，單位面積產(chǎn)量高，淀粉產(chǎn)出量高，素有“地下糧倉(cāng)”、“淀粉之王”和“能源作物”之美譽(yù)[1]。目前木薯主要用途是食用、飼用和在工業(yè)上的開(kāi)發(fā)利用。其中90%以上的木薯主要用于淀粉和變性淀粉的生產(chǎn)。近年來(lái)用木薯作為能源植物生產(chǎn)燃料乙醇，使得國(guó)家可再生能源法將木薯列為發(fā)展生物質(zhì)能源的少數(shù)幾種植物之一，能源木薯產(chǎn)業(yè)顯示出極大的發(fā)展?jié)摿2]。

廣西是我國(guó)最大的木薯種植省區(qū)，其木薯乙醇產(chǎn)量、變性淀粉、山梨醇等產(chǎn)量均居全國(guó)前列，木薯及其產(chǎn)品群總值也位居全國(guó)之首[3]。目前生產(chǎn)上木薯多采用成熟的莖段進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，這種方式繁殖率低，導(dǎo)致良種推廣速度慢。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)木薯進(jìn)行快速繁殖，將是加速木薯良種大面積推廣的有效途徑[4-6]。在木薯組織培養(yǎng)中，選擇適合的外植體，是其組織培養(yǎng)能否成功的一個(gè)關(guān)鍵。此外，木薯外植體表面和內(nèi)部常攜帶一些微生物，是組織培養(yǎng)過(guò)程的主要污染源，解決外植體污染是木薯組織培養(yǎng)能否成功的另一個(gè)關(guān)鍵。因此，在本研究中，針對(duì)木薯組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題，將重點(diǎn)研究外植體類型和滅菌方法對(duì)其組織培養(yǎng)效果的影響，以期為木薯組培快繁提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試品種為華南205的室外莖段和水培莖段，室外采樣地點(diǎn)為廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院大田。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1室外莖段取材和滅菌

取樣時(shí)間與滅菌過(guò)程：分別于5—6月、7—8月、9—10月在田間選取木薯健康植株上帶芽的莖段作為外植體。將莖段從葉柄基部切除葉片，用洗衣粉溶液浸泡10～15min，再用自來(lái)水沖洗10～15min，然后將莖段切成帶1～2個(gè)芽、長(zhǎng)約1.5cm的小段，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面滅菌，方法如下：75%乙醇漂洗20s后，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2溶液中，滅菌時(shí)間設(shè)5、7、10min3個(gè)處理。滅菌期間不斷搖動(dòng)，使外植體與滅菌劑充分接觸。經(jīng)上述滅菌處理后無(wú)菌水沖洗5～6次，接種到MS培養(yǎng)基中。

外植體類型：將帶芽莖段分為3個(gè)部分，頂芽以下第1～2個(gè)芽為上部；第3～6個(gè)芽為中部；第7個(gè)芽以下為下部。按照上述方法對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理后，用75%乙醇進(jìn)行表面滅菌20s，無(wú)菌水沖洗1次，再加入含有吐溫的0.1%HgCl2的溶液中滅菌5min，最后用無(wú)菌水沖洗5～6次，接種到MS培養(yǎng)基中。

1.2.2水培莖段取材與滅菌

田間采集的莖段經(jīng)剪截處理后，將莖段基部浸入清水中5cm左右，2d換水1次，4d修剪枝條基部截面1次，并小心刷凈枝條基部污垢，以防導(dǎo)管堵塞，影響水分吸收。待水培芽長(zhǎng)至15cm左右時(shí)剪下作為接種外植體。滅菌方法如下：0.1%HgCl2滅菌4、5、6min，然后無(wú)菌水沖洗5～6次，之后接種到MS培養(yǎng)基中。培養(yǎng)天后統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

1.2.3培養(yǎng)條件

接種后的材料均在25±5℃的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天以1600～2000lx的光照強(qiáng)度照射約10h。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

以上試驗(yàn)均于1周內(nèi)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。污染率=污染株數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%；成活率=成活數(shù)/（外植體總數(shù)-污染數(shù)-死亡數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1取樣和滅菌時(shí)間對(duì)外植體培養(yǎng)的影響

從表1可知，取樣時(shí)間和滅菌時(shí)間共同影響外植體培養(yǎng)效果，其中5—6月污染控制難度大，3個(gè)滅菌處理控制污染的效果均不理想，污染率最高達(dá)到100%；7—8月污染控制較為容易，隨著滅菌時(shí)間的增加，污染率從66.7%降到44.1%；9—10月份污染控制效果最理想，污染率最低為35.0%。為將污染率和死亡率控制到最低，不同取樣時(shí)期需要不同的HgCl2處理時(shí)間，其中7—8月份取樣時(shí)HgCl2處理時(shí)間需控制在10min內(nèi)，9—10月份取樣時(shí)HgCl2處理時(shí)間需控制在5min。

2.2外植體部位對(duì)其組織培養(yǎng)效果的影響

從表2可看出，外植體部位對(duì)其組織培養(yǎng)效果影響很大，其中靠近頂芽的莖段太幼嫩，雖然污染少，但由于組織太幼嫩，很容易被乙醇和HgCl2損傷，所以接種后大部分莖段褐化死亡，因此不適合作為組織培養(yǎng)的外植體；第7位及以下的芽位莖段中大部分是海綿狀的髓部，很難徹底消毒，所以也不適合作為外植體；而頂芽以下第3～6個(gè)芽較幼嫩，成活率相對(duì)較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

2.3滅菌時(shí)間對(duì)水培外植體組織培養(yǎng)效果的影響

由于水培的木薯莖段組織幼嫩，因此不采用乙醇和HgCl2結(jié)合的滅菌方法。單獨(dú)使用0.1%HgCl2溶液處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率降低，但其成活率也相應(yīng)降低，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到6min時(shí)，成活率為70.0%（表3）。綜合比較，0.1%HgCl2處理5min是水培芽最適宜的滅菌方法。

3結(jié)論與討論

外植體選擇是影響組培微繁效果的一個(gè)非常重要的因素。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同來(lái)源的外植體污染率存在很大差異，用水培方法獲得的外植體污染率低、存活率高，而室外莖段由于長(zhǎng)時(shí)間暴露在田間，菌類孳生，作外植體時(shí)，污染率較高。盡管水培莖段培養(yǎng)具有污染率低、存活率高等優(yōu)點(diǎn)，但水培莖段受時(shí)間條件制約，同時(shí)水培時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)自身儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗而影響外植體質(zhì)量。對(duì)于組織培養(yǎng)工廠化育苗來(lái)說(shuō)，要求年繁殖數(shù)達(dá)到百萬(wàn)株或者更多，用水培莖段做外植體則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求。因此，將2種外植體同時(shí)用于實(shí)踐，在各個(gè)時(shí)期相互補(bǔ)充，才能不斷滿足木薯種苗周年生產(chǎn)的要求。在用室外莖段做外植體時(shí)，外植體選取的時(shí)期、部位對(duì)污染的影響都至關(guān)重要[7]。應(yīng)根據(jù)取材時(shí)間外植體污染控制的難易程度，充分考慮污染因素，調(diào)整滅菌方案。植物組織培養(yǎng)中外植體種類的選擇以污染少、易啟動(dòng)為原則[8-9]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)外植體部位對(duì)組織培養(yǎng)效果影響的研究，發(fā)現(xiàn)木薯頂芽以下第3～6個(gè)芽較幼嫩，成活率相對(duì)較高，而且容易滅菌，適合作為外植體。

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