基于細胞面積估計的藍藻細胞計數

胡洋洋， 王 鑫

(江南大學 教育部輕工過程先進控制重點實驗室，江蘇 無錫214122)

環境問題是我國可持續發展面臨的重大問題，水污染是環境問題中的重點之一。太湖水污染導致藍藻水華爆發，造成嚴重的后果。因此，淡水水體中的藍藻細胞濃度的測量十分重要。目前，測量細胞濃度的方法主要有:細胞計數儀法、菌落計數器法、庫爾特計數器法、分光光度測定法［1］和熒光法、流式細胞儀法、細胞計數傳感器法［2］與圖像處理法［3］。

調研與實驗表明，在基于圖像處理的細胞計數［4］中，主流方法是先圖像分割，再進行隔離標記計數，該方法對細胞圖像的前期分割處理要求很高，而且對細胞較多或細胞粘連程度較大的圖片進行計數的結果誤差很大;而常用的基于細胞核定位的計數方法對原核細胞的藍藻細胞而言也是不適用的;已有的基于面積的紅細胞計數方法［5］則沒有經過細胞預分割環節，直接根據每個不連通區域的大小判斷該區域代表的細胞數目，再進行統計計數，該方法對于平均細胞面積獲取的先驗性很差，而且最終計數結果誤差較大。

針對以上問題，文中提出了基于細胞面積估計的細胞計數法(簡稱“面積法”)。特別地，為了改善細胞面積估計的精度，將二值化后的細胞圖像中的細胞面積作為一個隨機變量，并借助基于核平滑的概率密度估計找到了單個細胞面積最可能的值。

1 理論分析

細胞計數的圖像處理法，是將原始顯微細胞圖像進行二值化，預分割以后再進行細胞計數。

1.1 圖像預處理

在用顯微鏡獲取細胞溶液的圖片后，首先要進行圖像預處理。圖像預處理包括對輸入圖像進行特征提取、分割以及匹配前所進行的處理。圖像預處理的主要目的是消除圖像中無關的信息，恢復有用的真實信息，增強有關信息的可檢測性，最大限度地簡化數據，從而改進特征抽取、圖像分割、匹配和識別的可靠性。預處理的方法有很多，在細胞計數中主要應用到的是二值化［6］和形態學運算［7-8］。

二值化是圖像分割的一種方法。在二值化圖像時把大于某個臨界灰度值的像素灰度設為灰度極大值，把小于這個值的像素灰度設為灰度極小值，從而實現二值化。臨界灰度值也稱閾值。根據閾值的選取準則不同，二值化的算法分為固定閾值和自適應閾值。比較常用的二值化閾值選取算法有:雙峰法、P 參數法、迭代法與OTSU 法［9］等。文中二值化域值選取的是OTSU 法。它是一種基于灰度直方圖的閾值選取方法。它選取使類間方差最大的灰度級作為分割閾值。

距離變換是對二值圖像的一種操作運算，它將一幅二值圖像轉化為一幅灰度圖像，在這幅灰度圖像中，每個像素的灰度級是該像素與距其最近的背景間的距離。從理論上講，要計算一個像素點到背景像素點的最短距離，需要對圖像進行全局操作運算，即計算此像素點與所有背景像素點的距離，再取最小值。除非這幅數字圖像的尺寸非常小，否則這種全局操作的計算量是非常大的。實際運用中的距離變換實現算法是從鄰近像素點入手，每次只計算其與局部相鄰的幾個像素點距離的最小值，根據全局距離是局部距離按比例疊加而成的原理，對圖像進行前后兩次掃描，最終得到近似的距離。圖像基于上述原理，實踐中用倒角算法進行距離變換，簡單快速，其計算出的距離合理逼近于真實的歐氏幾何距離。

分水嶺算法［10］最早是由Vincent L 和Soille P提出來的。分水嶺算法是模擬一個水面浸沒地形的過程。在分水嶺算法中，圖像中每一點像素的灰度值表示該點的海拔高度，每一個局部極小值及其影響區域稱為集水盆，而集水盆的邊界則形成分水嶺。最后得到的分水嶺邊界將原圖像粘連細胞切割開。

1.2 基于細胞面積估計的細胞計數

在完成以上的圖像預處理后，即可進行細胞計數。通常基于隔離標記計數法的細胞計數是對二值化后的圖像各個分離區域進行標記并累加計數，從而得到圖片中細胞的數目。這種方法的一個基本假定是一個隔離區域代表一個細胞，但在高度粘連(部分區域粘連呈塊狀)的細胞圖像中，經過預分割后仍然會出現多個細胞粘連的單個分離區域，隔離標記計數法對于這種情況的計數仍然為1，并沒有反映真實情況。

文中假定經過預分割的細胞圖像中還存在重疊細胞，且重疊細胞是少數。在此前提下，將圖片中分離的細胞區域的面積作為一個隨機變量，通過核平滑對其進行概率密度估計，得到它的概率密度函數曲線。假設重疊細胞較少，該曲線的極大值對應的細胞區域面積即為單個細胞面積最可能的值，即前述隨機變量的眾數。用圖像中細胞區域的總面積除以前面得到的單個細胞面積最可能的值，即可算出圖像中的細胞總數。

之所以使用眾數而不是均值作為細胞面積最可能的值，是因為藻液中的細胞生長速度不一定一樣，有各個生長階段的細胞導致細胞大小參差不齊。

特別地，細胞面積估計中用到的基于核平滑的概率密度估計［11］是概率論中用以估計隨機變量的概率函數密度的方法之一。它采用平滑的峰值函數(“核”)［12］擬合觀察到的數據點，從而對真實的概率分布曲線進行模擬。在一定程度上其性質比直方圖更好，可以替代直方圖精確展示數據總體的概率分布。

2 實驗設計

2.1 細胞圖像來源

文中實驗采用的細胞圖像均來自業界權威的細胞計數標準樣本圖像網站(www.broad.mit.edu/bbbc)。

2.2 圖像預處理

首先讀取RGB 格式的原始圖片，將彩色圖像通過加權平均法轉化為灰度圖像，再采用OTSU 方法將圖像二值化，然后采用形態學閉運算填充細胞內空隙。該方法處理以后的細胞圖像，能平滑細胞區域邊界并可以最大程度地保持細胞區域面積不變，圖像信息完整。

2.3 距離變換分水嶺分割

將得到的二值化細胞圖像進行歐氏距離變換并采用分水嶺算法進行初步預分割，將粘連程度不大的細胞區域分割開，便于后續操作。

該算法原理是:首先利用距離變換將細胞像素點不同的位置信息轉化為不同的灰度信息，再利用分水嶺算法區分不同性質的像素點，然后將邊界點標出，邊界即可將細胞群分開為單個的細胞。

2.4 “面積法”細胞計數

使用高斯核作為概率密度估計［13-14］的平滑核函數，并限定概率密度函數的取值范圍為非負實數集，對分離的細胞區域面積進行概率密度估計，得到單個細胞面積最可能的值。最后，圖像中細胞區域的總面積除以單個細胞面積最可能的值，得到圖像中的細胞總數。

3 實驗結果分析

圖1 為預分割粘連細胞區域圖像。其中，圖1(a)與圖2(b)是兩張實驗用的細胞圖像經過圖像預處理后的一部分，對它們進行距離變換以及分水嶺算法分割后得到圖1(c)和圖1(d)的效果。

由圖1 可以看出，經過預分割后的細胞圖像，粘連程度低的細胞區域被分割開。預分割后的細胞圖像中，單個細胞的數量占大多數。再對預分割后的圖像中細胞區域面積進行高斯核密度估計，具體結果如圖2 所示。其中，* 所對應X 軸的值就是估計出的細胞平均面積S。

最后，用整個細胞圖中的細胞區域的總面積Sum除以各自的單個細胞面積最可能的值S，得到圖像中細胞的總數。經過計算統計得到最終結果(見表1)。本實驗選取輕度粘連和高度粘連兩種程度的圖像，每種粘連程度取10 張樣本圖像，計數結果是10 個樣本的平均值，并進行了四舍五入的處理。所有的樣本圖像均含有300 個細胞。顯微圖像放大倍數為1 000 倍。

圖1 預分割粘連細胞區域圖像Fig.1 Area image the pre-segmentation adhesion cell

圖2 核密度估計的細胞平均面積Fig.2 Cell average area of the kernel density estimation

表1 實驗結果Tab.1 Experimental results

由表1 可以看出，不連通區域標記法雖然能較好地處理含細胞較少或粘連度較小的圖片，但是對含細胞較多特別是粘連程度較大的圖片進行計數所得出的細胞數結論誤差較大。而“面積法”在這兩種不利情況下得出的結論都有較高的準確度，不僅能對細胞數較少粘連程度低的圖片準確計數，還能對粘連程度大的細胞圖片進行精確的細胞計數。

4 結 語

文中使用圖像處理技術對藍藻細胞的顯微鏡圖像進行細胞計數。提出的“面積法”克服了不連通區域標記法對分割后的細胞圖像進行細胞計數不能有效處理細胞數較多或細胞粘連程度較大情況，有效地解決了復雜情況下的細胞計數問題。實驗結果顯示，“面積法”對于細胞高粘度圖像的計數優勢明顯，計數精度達97%，而普通不連通區域計數法的計數精度只有72%，表明“面積法”的計數準確度與穩定性遠高于隔離標記計數法。此外，由于概率方法的引入，“面積法”本質上對圖像中的不確定因素不敏感，故對圖像的質量及圖像預處理的要求較低。

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