卡尼鄂拉蜂工蜂咽下腺解剖形態學和超微結構研究

吉挺+沈芳+劉振國

摘要：為了分析卡尼鄂拉蜂（Apismelliferacarnica）工蜂咽下腺發育的不同階段解剖形態和超微結構變化規律，探討咽下腺在工蜂分泌王漿過程中的細胞學機制，運用掃描電鏡和透射電鏡方法比較分析5個不同日齡內勤蜂（3、6、9、12、16日齡）和3個不同階段越冬蜂（越冬階段、春繁階段、淘汰階段）工蜂小囊發育飽滿程度和細胞超微結構。結果表明，3日齡工蜂咽下腺小囊發育尚未完全，而線粒體、內質網等細胞器已經出現；9日齡工蜂咽下腺小囊直徑極顯著大于其他日齡內勤蜂工蜂（P<0.01），發育最為飽滿，內質網、核糖體、導管等細胞器成分也最為豐富；春繁階段越冬蜂工蜂咽下腺小囊直徑極顯著大于其他階段越冬蜂（P<0.01），與9日齡工蜂相比差異不顯著（P>0.05），但細胞器數量較9日齡有所下降；淘汰階段越冬蜂和16日齡工蜂咽下腺細胞出現崩解現象。說明卡蜂咽下腺小囊總體發育較為遲緩；伴隨蜂王漿分泌，內勤蜂和越冬蜂咽下腺小囊發育均呈現“飽滿—萎縮”的發育規律；多個細胞器參與蜂王漿的合成和分泌，細胞器豐富程度反映出工蜂泌漿能力的高低。

關鍵詞：卡尼鄂拉蜂；咽下腺；掃描電鏡；透射電鏡

中圖分類號：S891+.3文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0247-04

咽下腺位于工蜂頭腔內，是1對高度盤繞的長串葡萄狀腺體，每條腺體包括1根分泌導管和數以百計的囊泡[1]。作為蜜蜂工蜂特有的蜂王漿合成分泌的主要組織[2-3]，承擔著蜂王漿主要營養成分如蛋白質、糖類及脂類物質的分泌職能。咽下腺自1956年被命名以來，其發育形態和超微結構的研究有了長足的發展。曾志將等比較意蜂與中蜂咽下腺小囊大小、長度和寬度差異，發現同品種間各日齡內勤蜂咽下腺小囊數量差異不顯著，而意蜂咽下腺小囊平均數量比中蜂多61.3%，長度長35.7%，寬度差異不顯著，并且意蜂咽下腺小囊細胞的細胞器更豐富[4]。Knecht等通過對蜜蜂咽下腺顯微結構觀察發現，工蜂羽化出房后，粗面內質網迅速增多，8日齡工蜂達到最大；外勤蜂粗面內質網數量減少，與咽下腺分泌活性相一致[5]。胡福良等對產漿量不同的3種意蜂不同日齡工蜂咽下腺的超微結構比較發現，高產漿性能的浙農大1號意蜂咽下腺小囊數量較之王漿低產意蜂品種高出14.7%，且細胞線粒體、粗面內質網、分泌顆粒等結構豐富，初步揭示了王漿高產性能和咽下腺細胞超微結構、分泌生理機制之間的關系[6]。Deseyn等發現，3日齡的工蜂咽下腺小囊已經存在，到6日齡時最為發達，隨后小囊數量開始減少，而21日齡采集蜂咽下腺小囊消失，頭部只存在其萎縮退化的結構，不再分泌蜂王漿；越冬蜂咽下腺小囊中有大量的分泌囊泡，其中儲備的分泌物將在春繁時用以飼喂幼蟲[7]。蘇松坤等通過對不同日齡漿蜂咽下腺小囊計數和顯微形態觀察，發現4～17日齡的漿蜂咽下腺小囊均有乳白色分泌物產生，泌漿期較原意長7～8d，從形態學角度闡述了漿蜂王漿高產的原因[8]。杜芝蘭通過對中華蜜蜂工蜂咽下腺的超微結構觀察，描述了粗面內質網、高爾基復合體、線粒體、分泌塊等細胞器的形態結構和分泌導管，基本闡明中蜂王漿的合成及轉運途徑[9]。馬衛華等對意蜂咽下腺結構和功能進行了分析，推斷咽下腺具有分泌王漿和消化酶的功能[10]。

咽下腺分泌活性受蜂群結構、氣候、日齡等因素的影響。一般認為在群勢正常、群體結構完整蜂群中，6～12日齡內勤蜂咽下腺充分發育，分泌活性最為活躍，承擔飼喂小幼蟲和蜂王工作。Knecht等通過免疫組化技術檢測工蜂咽下腺小囊內王漿蛋白含量，發現8日齡蛋白含量最多，表明咽下腺在8日齡前后分泌活性最強。越冬蜂在蜂群越冬期間不承擔哺育與采集任務，其咽下腺分泌活性得到最大程度保留[5]。在越冬蜂咽下腺中檢測到少量王漿蛋白存在，表明越冬蜂咽下腺始終攜帶有王漿蛋白[5]；到春繁階段后因受到幼蟲食物（蜂花粉）和蜂王恢復產卵等外界環境因素的影響，越冬蜂泌漿行為又將開啟，并表現出足夠的哺育幼蟲能力，直至有新的內勤蜂出房加以替代[7]。由此可知在正常蜂群中，西方蜜蜂工蜂咽下腺分泌王漿應在內勤蜂6～12日齡與越冬蜂春繁階段。

卡尼鄂拉蜂（簡稱卡蜂，拉丁學名Apismelliferacarnica）是我國除意蜂之外分布最廣的西方蜜蜂地理亞種。作為王漿低產品種，其咽下腺發育機制被研究者所忽視。通過對卡蜂不同發育時期咽下腺形態與超微結構，對比較不同產漿性能蜂種咽下腺發育差異更具意義。

基于上述觀點，筆者采集了卡蜂咽下腺泌漿前后5個不同日齡（3、6、9、12、16日齡）的內勤蜂及3個不同階段（越冬階段、春繁階段和淘汰階段）的越冬蜂，分別研究其咽下腺發育形態和超微結構，以期闡明咽下腺發育和應答調節機制，為研究咽下腺在蜜蜂社會分工中的作用提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究所用的卡蜂單雄授精蜂王由吉林省養蜂科學研究所提供，蜂群由揚州大學實驗蜂場試驗場組織，飼養期間提供充足的糖水和花粉，周邊有零星的油菜蜜源。

對新羽化出房工蜂背部進行標記，在2013年5月采集3、6、9、12、16日齡的內勤蜂，2014年1—3月采集越冬階段（winterbee，1月中旬）、春繁階段（springmultiplicationbee，2月中旬）和淘汰階段（retiredbee，2月底）工蜂。每個時間點各取30只，于解剖鏡下迅速解剖咽下腺，置于2.5%戊二醛中，4℃保存。

1.2主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑配制0.2mol/L磷酸緩沖液：精確稱量NaH2PO4·H2O5.2g、Na2HPO4·12H2O58g，加雙蒸水定容至1L，pH值調至7.4。2.5%戊二醛：量取25%戊二醛母液10mL，加入0.2mol/L磷酸緩沖液40mL，加雙蒸水定容到100mL。1%OsO4：將裝有1gOsO4的安瓿瓶洗凈，放入裝有100mL水的棕色試劑瓶中，在通風櫥內把安瓿瓶敲破，配制成1%水溶液（提前配制，4℃密封保存）。endprint

1.2.2主要設備PS48型體視顯微鏡（上海光學儀器廠）；刻蝕鍍膜儀（BAL-TECsputtercoater，SCD500）；HitachiHCP-2型臨界點干燥儀（Hitachi公司）；XL-30ESEM型環境掃描電子顯微鏡（Philips公司）；Tecnai12型透射電子顯微鏡（Philips公司）；RM2235型徠卡超薄切片機（LeicaBiosystems公司）。

1.3研究方法

1.3.1掃描電鏡（SEM）將剖取的咽下腺（15頭）迅速轉移到2.5%戊二醛固定液中（4℃，2h）保存，以盡可能保持細胞原有生活狀態，減少組織結構變化。經PBS清洗3次，15min/次，1%OsO4固定后再用PBS清洗3次，15min/次，再經系列濃度乙醇[50%、70%、80%、90%、100%、100%（加無水硫酸鈉）]脫水，每濃度15min，經乙酸戊酯∶乙醇=1∶1處理30min后轉入純戊酯中處理30min，然后經CO2臨界點干燥24h，樣品處理結束。將樣品粘到載物片上，經表面鍍膜處理后電鏡觀察（揚州大學測試中心），腺泡小囊直徑測量和發育程度評價為形態學觀察提供依據，數據統計采用SPSS16.0的t檢驗。

1.3.2透射電鏡（TEM）樣本經戊二醛固定液中（4℃，2h），經PBS清洗3次，15min/次，1%OsO4固定后再用PBS清洗3次，15min/次，系列濃度乙醇（50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇）逐級脫水，乙醇∶丙酮=1∶1、100%丙酮各15min，包埋劑與丙酮的混合液（體積比1∶1）處理樣品1h，用包埋劑與丙酮的混合液（體積比3∶1）處理樣品3h，純包埋劑處理樣品過夜。將經過滲透處理的樣品包埋起來，70℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Leica超薄切片機中切片，獲得70～90nm的切片，該切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，即可在透射電鏡中觀察。

2結果與分析

2.1不同日齡工蜂咽下腺形態學掃描電鏡觀察

掃描電鏡結果（圖1）表明，隨著日齡的增大，內勤蜂咽下腺小囊直徑總體上呈現“飽滿—萎縮”的趨勢。3日齡工蜂咽下腺發育尚未完全，呈不規則囊泡狀結構，表面褶皺，無法對其小囊直徑進行測量。隨后咽下腺小囊逐步發育，6日齡工蜂咽下腺小囊形狀規則，表面光滑，大小不一，排列稀疏；9日齡工蜂咽下腺小囊排列緊密，發育最為飽滿，小囊直徑極顯著大于其他日齡內勤蜂階段（P<0.01，n≥34）（圖2）。12、16日齡咽下腺小囊直徑下降，6、12、16日齡之間無統計學差異（P>0.05）。

越冬蜂不同階段咽下腺小囊直徑變化規律與前者相似，咽下腺小囊直徑在春繁階段達到最大值，與9日齡工蜂差異不顯著（P>0.05），較越冬蜂和淘汰蜂有顯著的統計學意義（P<0.01，n≥34）。越冬階段工蜂咽下腺小囊發育飽滿，直徑近似于16日齡，但排列松散，且形狀不規則；春繁階段工蜂咽下腺小囊排列緊密，并相互擠壓成簇，囊泡分支較多；淘汰階段工蜂咽下腺小囊出現脫落和崩解。

2.2不同日齡工蜂咽下腺超微結構透射電鏡觀察

透射電鏡結果（圖3）顯示，3日齡工蜂咽下腺小囊細胞內線粒體較為豐富，并出現分泌顆粒，表明此階段細胞較為活躍，可能已經合成王漿蛋白，并以分泌顆粒的形式，存儲在分泌泡中[9]。6日齡出現了粗面內質網和胞外管，表明蛋白質合成轉運結構已經發育完善，為后續王漿分泌高峰期打下基礎。9日齡的線粒體明顯增多，分布較為分散，出現大量的存儲泡和分泌顆粒，大小不一，著色較深，占據細胞的大部分體積，呈現聚集現象。12日齡小囊細胞體積萎縮，線粒體數量減少，細胞質出現了空泡結構。16日齡中幾乎沒有線粒體出現，核仁增大，溶酶體數量增多。

越冬蜂在其越冬階段，工蜂咽下腺小囊細胞形態與16日齡相似，排列緊密，細胞器較少；春繁階段，工蜂咽下腺小囊細胞內線粒體、粗面內質網和分泌顆粒增多，胞外導管發達，但和內勤蜂9日齡相比，細胞器排列相對較為稀疏，且細胞器的數量也較少；越冬蜂在淘汰階段，細胞結構明顯不完整，細胞質偏移，出現了崩解現象。

3討論

電鏡技術越來越多地應用到了生物樣本組織結構變化、超微結構觀察等分析中，為在生理調節過程等生物學研究提供形態依據，在生命科學研究領域發揮著重要作用。

掃描電鏡結果表明，3日齡卡蜂工蜂咽下腺尚未發育完全，存在很多皺褶，形態不規則，無法準確測量小囊直徑和進行數據統計。而馮毛在對1日齡的漿蜂和原意工蜂頭部解剖中都發現了發育較為完備的咽下腺[11]，表明意蜂內勤蜂咽下腺較卡蜂發育早。和意蜂相比，卡蜂的工蜂泌漿能力較低，可能與其咽下腺發育遲緩有一定關系。3日齡的工蜂不承擔王漿分泌工作[12]，但透射電鏡結果顯示，3日齡卡蜂的咽下腺小囊細胞內已出現了數量較多的線粒體，可能此時小囊內已有王漿合成，此結果與Knecht研究結果[5]相似；同時透射電鏡未見細胞間的分泌導管結構，表明3日齡工蜂咽下腺小囊內有王漿合成，但不能分泌王漿，其現有細胞結構將為后續日齡工蜂咽下腺大量合成和分泌蛋白質提供支持。

在工蜂社會分工中，6～12日齡是其分泌王漿、飼喂小幼蟲的時期。電鏡結果表明，從6日齡始，工蜂咽下腺小囊漸變飽滿，細胞結構和細胞器出現相應改變，具體表現在粗面內質網、線粒體等細胞器漸變豐富，存儲泡和轉運導管大量出現，其中以9日齡最為顯著。9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大（P<0.01），各種與蛋白合成與分泌相關的細胞器最為豐富，表明在此日齡王漿蛋白得到充分合成并存儲在細胞內的存儲泡，使咽下腺小囊膨大。而到16日齡，咽下腺小囊細胞內出現較多的溶酶體，細胞結構的完整性被破壞，細胞崩解，細胞功能喪失，導致王漿蛋白合成和分泌功能喪失，在形態學上體現為小囊萎縮。由此可見，內勤蜂咽下腺小囊細胞器的豐富程度變化與其分泌王漿活性是一致的。endprint

同樣越冬蜂在其越冬階段里，工蜂咽下腺形態飽滿，但細胞器結構較少，僅有少量的粗面內質網和線粒體結構，蜂群內囚王限卵的狀態制約著越冬蜂咽下腺分泌王漿的活性，使其泌漿行為趨于停滯[13]。而春繁階段越冬蜂在幼蟲信號和采食花粉等營養物質的刺激下，細胞內蛋白合成和分泌相關細胞器結構豐富，使咽下腺小囊膨大，咽下腺呈現分泌活性。但越冬蜂在春繁階段咽下腺小囊細胞器水平低于9日齡工蜂，表明春繁階段工蜂王漿合成和分泌的能力較9日齡工蜂低，這一點與春繁蜂飼喂養能力不如適齡工蜂強[14]相一致。由此，不同日齡、不同階段工蜂的飼喂能力差異在電鏡分析得到合理解釋。

綜上所述，通過對卡蜂咽下腺小囊外部形態和細胞內部結構電鏡分析表明，卡蜂工蜂咽下腺小囊總體發育較為遲緩，隨著日齡增加，咽下腺小囊直徑呈現“飽滿—萎縮”的趨勢，細胞結構出現“漸變增多—逐漸減少”的變化。不同日齡內勤蜂中，9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高；在越冬蜂中，春繁階段工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高，但其細胞器水平均低于9日齡工蜂，表明咽下腺小囊內細胞器的水平反映了蜜蜂泌漿能力的高低。

致謝：感謝吉林省養蜂科學研究所薛運波所長、牛慶生研究員為本試驗提供卡尼鄂拉蜂蜂王；感謝揚州大學測試中心老師對本試驗電鏡數據采集的指導和幫助。

參考文獻：

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[14]徐士磊，石麗萍.蜜蜂生物學特性在飼養管理中的合理利用[C].中國養蜂學會蜜蜂飼養管理專業委員會第十三次學術研討會，江蘇揚州，2007年4月.endprint

同樣越冬蜂在其越冬階段里，工蜂咽下腺形態飽滿，但細胞器結構較少，僅有少量的粗面內質網和線粒體結構，蜂群內囚王限卵的狀態制約著越冬蜂咽下腺分泌王漿的活性，使其泌漿行為趨于停滯[13]。而春繁階段越冬蜂在幼蟲信號和采食花粉等營養物質的刺激下，細胞內蛋白合成和分泌相關細胞器結構豐富，使咽下腺小囊膨大，咽下腺呈現分泌活性。但越冬蜂在春繁階段咽下腺小囊細胞器水平低于9日齡工蜂，表明春繁階段工蜂王漿合成和分泌的能力較9日齡工蜂低，這一點與春繁蜂飼喂養能力不如適齡工蜂強[14]相一致。由此，不同日齡、不同階段工蜂的飼喂能力差異在電鏡分析得到合理解釋。

綜上所述，通過對卡蜂咽下腺小囊外部形態和細胞內部結構電鏡分析表明，卡蜂工蜂咽下腺小囊總體發育較為遲緩，隨著日齡增加，咽下腺小囊直徑呈現“飽滿—萎縮”的趨勢，細胞結構出現“漸變增多—逐漸減少”的變化。不同日齡內勤蜂中，9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高；在越冬蜂中，春繁階段工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高，但其細胞器水平均低于9日齡工蜂，表明咽下腺小囊內細胞器的水平反映了蜜蜂泌漿能力的高低。

致謝：感謝吉林省養蜂科學研究所薛運波所長、牛慶生研究員為本試驗提供卡尼鄂拉蜂蜂王；感謝揚州大學測試中心老師對本試驗電鏡數據采集的指導和幫助。

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同樣越冬蜂在其越冬階段里，工蜂咽下腺形態飽滿，但細胞器結構較少，僅有少量的粗面內質網和線粒體結構，蜂群內囚王限卵的狀態制約著越冬蜂咽下腺分泌王漿的活性，使其泌漿行為趨于停滯[13]。而春繁階段越冬蜂在幼蟲信號和采食花粉等營養物質的刺激下，細胞內蛋白合成和分泌相關細胞器結構豐富，使咽下腺小囊膨大，咽下腺呈現分泌活性。但越冬蜂在春繁階段咽下腺小囊細胞器水平低于9日齡工蜂，表明春繁階段工蜂王漿合成和分泌的能力較9日齡工蜂低，這一點與春繁蜂飼喂養能力不如適齡工蜂強[14]相一致。由此，不同日齡、不同階段工蜂的飼喂能力差異在電鏡分析得到合理解釋。

綜上所述，通過對卡蜂咽下腺小囊外部形態和細胞內部結構電鏡分析表明，卡蜂工蜂咽下腺小囊總體發育較為遲緩，隨著日齡增加，咽下腺小囊直徑呈現“飽滿—萎縮”的趨勢，細胞結構出現“漸變增多—逐漸減少”的變化。不同日齡內勤蜂中，9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高；在越冬蜂中，春繁階段工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高，但其細胞器水平均低于9日齡工蜂，表明咽下腺小囊內細胞器的水平反映了蜜蜂泌漿能力的高低。

致謝：感謝吉林省養蜂科學研究所薛運波所長、牛慶生研究員為本試驗提供卡尼鄂拉蜂蜂王；感謝揚州大學測試中心老師對本試驗電鏡數據采集的指導和幫助。

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[14]徐士磊，石麗萍.蜜蜂生物學特性在飼養管理中的合理利用[C].中國養蜂學會蜜蜂飼養管理專業委員會第十三次學術研討會，江蘇揚州，2007年4月.endprint