2種海洋弧菌的鑒定及人工感染大黃魚病理分析

2015-01-15 20:35:23陳心馬蓉張藝石志祥

江蘇農業科學 2014年11期

陳心+馬蓉+張藝+石志祥

摘要：從形態學、生化特性、分子生物學水平對2種海洋弧菌進行菌種鑒定，將這2株菌制作成混合菌液，對大黃魚進行攻毒試驗。對2菌株16SrDNA進行PCR擴增，產物長度分別為1389、1477bp。利用BLAST進行比對，結果顯示菌株090625的序列與哈維氏弧菌的同源性高達99%；而菌株070925的序列與副溶血弧菌同源性高達99%。攻毒試驗發現，大黃魚體親魚表皮下出血和肝臟、脾臟等組織都出現了典型的弧菌感染病癥，大黃魚幼魚則未出現感染現象。菌株090625為哈維氏弧菌，菌株070925為副溶血弧菌。大黃魚親魚比幼魚更容易感染細菌。

關鍵詞：菌種鑒定；哈維氏弧菌；副溶血弧菌；大黃魚

中圖分類號：S944文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0251-03

隨著海水養殖業的蓬勃發展特別是高密度養殖模式的推廣，養殖生物的細菌性疾病發生頻率和發病范圍逐漸增大。據調查，在細菌性疾病中，弧菌屬細菌引起的疾病占很大比例?；【鷮偌毦鷱V泛存在于沿岸海水[1]、沉積物、海洋動物體中，被認為是海水魚、蝦、蟹類的一種常見致病菌[2-4]。大黃魚（Pseudosciaenacrocea）隸屬于鱸形目（Perciformes）石首魚科（Sciaenidae），主要分布于中國、朝鮮沿海水域，為我國主要海產經濟魚類之一[3]。隨著大黃魚親魚培育和人工育苗等關鍵技術的突破，以及人工養殖技術的不斷提高，大黃魚養殖產業得到迅猛發展。但由于養殖規模擴大等原因，各種病害發生也日益頻繁，尤其是細菌性疾病嚴重威脅著大黃魚養殖業的健康發展[5-7]。本研究從患病中華烏塘鱧（Bostrychussinensis）內分離出致病菌，對大黃魚進行人工感染，觀察病癥發生情況，旨在為大黃魚臨床診斷、致病機理研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源2種海洋弧菌從患病中華烏塘鱧中分離。

1.1.2供試材料健康大黃魚（均質量0.5kg）購自福建省寧德市養殖網箱；患病中華烏塘鱧（均質量0.5kg）由福建省東山縣鑫宇海水養殖場提供；健康褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus，平均質量0.5kg）購自福建省廈門市大學路水產市場。

1.1.3試劑蛋白胨（tryptone，LP0042）、酵母提取物（yeastextract，LP0042）、TCBS培養基均購自英國Oxoid公司；RNAlater購自北京Bioteke公司；ExTaqDNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑均為進口或國產分析純。

1.1.4儀器設備自動微生物檢測系統（AMS）VITEKJR和自動微生物檢測系統革蘭氏陰性菌種鑒定卡為法國生物梅里埃公司產品；9700型PCR儀為美國PE公司產品；水平電泳槽為北京六一儀器廠產品；恒溫培養箱為太倉市華美生化儀器廠產品；HVE-50型全自動高壓滅菌鍋為日本Hirayama公司產品；AFX-1002-P型艾科浦超純水系統為臺灣頤洋企業發展有限公司產品；血小板計數器為浙江玉環縣求精醫用儀器廠產品。

1.2方法

1.2.1菌株分離用1.5%無菌生理鹽水反復清洗患病中華烏塘鱧體表。用75%乙醇拭擦體表，對取樣部位進行消毒。用無菌接種環分別穿刺體表潰爛部位組織，取少量樣品在TCBS培養基上劃線，30℃培養1d。挑取優勢菌落在TCBS培養基平板劃線分離數次，直至獲得純培養物菌株1、菌株2。

1.2.2回歸感染取15尾健康褐菖鲉置于水箱中，28℃海水充氣暫養2d，每天換水1/2。暫養無異常后用于回歸感染，將其中10尾魚分為A、B2個試驗組，另外5尾為對照組。用血小板計數法對菌株1、菌株2進行計數；用無菌生理鹽水分別將菌株1、菌株2稀釋，制成菌懸液1、菌懸液2，濃度均為1×1010CFU/mL。A組：每尾魚腹腔注射0.2mL菌懸液1；B組：每尾魚注射0.2mL菌懸液2；對照組：每尾魚注射0.2mL滅菌生理鹽水。觀察、記錄試驗魚發病及死亡情況。

1.2.3菌株再次分離取回歸感染試驗組中出現病灶的褐菖鲉體表潰爛部位樣品，在TCBS培養基和LB培養基平板上劃線分離數次，直至得到純化菌株。

1.2.4菌株鑒定

1.2.4.1形態學觀察利用肉眼直接觀察細菌菌落的外部形態。

1.2.4.2生化特性鑒定從分離菌株中取單菌落，利用自動微生物檢測儀VITEKJR的GNI鑒定卡進行生理生化鑒定，再分離菌株經自動微生物檢測儀GNI鑒定卡，檢測30個生化檢測項目。

1.2.4.3分子生物學方法鑒定將單菌落用ddH2O溶解，用作PCR反應的模板。以16SrRNA的保守區設計引物，進行PCR擴增，其中正向引物為16S-F（ATCGAACGCTGGCGGCAGGC），反向引物為16S-R（TCACCCCAGTCATGAAC）。PCR擴增反應體系：10×exTaqbuffer5μL，exTaqDNA聚合酶0.25μL（1.25U），dNTP4μL（各2.5mmol），模板DNA2μL（約0.5μg），引物1（16S-R）1μL（10μmol），引物2（16S-F）1μL（10μmol），加滅菌去離子水補足體積至20μL。反應程序：95℃預變性5min；95℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環；72℃終延伸7min。接著進行電泳檢測。將5μL樣品和2μL6×上樣緩沖液混合，加入點樣孔進行電泳。電壓為120V，約30min。電泳結束后，將瓊脂糖膠放入紫外燈下觀察。回收有目的條帶的樣品。配制1%TAE瓊脂糖膠進行產品回收。PCR產物檢測、測序。

1.2.5攻毒材料的制備將鑒定出的2種菌株涂布于LB培養基，30℃培養16h。用1.5%生理鹽水溶解菌株，2種菌株在生理鹽水中的最終濃度為1×108CFU/mL。采用哈維氏弧菌和副溶血弧菌的混合菌懸液為攻毒材料，比例為3∶1。endprint

1.2.6攻毒試驗

將大黃魚（均質量400g）分別置于約25℃的海水中暫養2d。分為1個試驗組、1個對照組，每組4尾魚。加入1～2滴丁香酚于水桶中麻醉試驗用魚。對試驗組注射混合菌液，注射劑量為1mL/kg；對照組注射同等劑量的生理鹽水。隨時觀察攻毒組和對照組魚體的活動情況，并及時進行記錄和拍照。

2結果與分析

2.1病原菌的獲取

采用無菌操作挑取樣品、細菌分離培養等方法，從福建省東山縣鑫宇海水養殖場患病中華烏塘鱧皮膚潰爛的病灶部位分離得到2種病原菌。2種菌株在TCBS平板上的菌落基本為黃色，圓形，隆起，邊緣整齊，不透明，其中1種較為黏稠。

2.2回歸感染結果

回歸感染3d后，A組褐菖鲉全部死亡，B組有3尾褐菖鲉死亡。死亡褐菖鲉肝臟和鰓的顏色發白，膽囊腫大，有的個體尾鰭和臀鰭邊緣出現輕微潰瘍。未死亡的試驗魚對外界刺激反應遲鈍，鰭出血，體表病變的部位有暗紅色瘀血，鱗片脫落，皮膚出現潰爛，表現出典型的弧菌病病癥。對照組褐菖鲉表現正常。從患病褐菖鲉重新分離純化感染菌株，進行生化和分子生物學鑒定。

2.3病原菌鑒定

2.3.1菌落外部形態鑒定

回歸感染后再分離獲得的菌株，在TCBS平板上98%以上的優勢菌落基本為黃色，菌落均為圓形、隆起、邊緣整齊、不透明；其中菌株2較為黏稠。菌落直徑約1mm，另外在大量優勢菌落中還夾雜少數綠色和菌落直徑約2mm的淺黃色菌落，均生長良好。回歸感染后鑒定，將菌株1命名為090625，菌株2命名為070925。

2.3.2生理生化檢測再分離菌株經自動微生物檢測儀GNI鑒定卡，結果見表1。其中，葡萄糖氧化、生長控制、蔗糖發酵等都顯陽性，具有典型的海洋弧菌生化特性。根據全自動細菌鑒定儀檢測結果，初步判斷這2種菌株均為海洋弧菌。

2.3.3分子生物學鑒定

以再分離菌株菌液為模板，利用PCR方法，擴增出2條大小為1000～2000bp的條帶。經過測序，得出2條長度分別為1389、1477bp的DNA鏈（圖1、圖2）。BLAST程序搜索NCBI基因庫中所有已登錄的同源序列，結果顯示菌株090625的序列與哈維氏弧菌最為相似，同源性高達99%；而菌株070925的序列與副溶血弧菌最為相似，同源性也高達99%。據此確認菌株090625為哈維氏弧菌，菌株070925為副溶血弧菌，并將二者的16SrRNA部分序列上傳GenBank，登錄號分別為GQ327950、EU170469。

2.3.4大黃魚攻毒試驗結果

2.3.4.1體表病變情況分析

對大黃魚親魚（已注射催產素）和大黃魚幼魚同時進行攻毒試驗。結果發現，攻毒后的大黃魚出現典型的海洋弧菌病灶。攻毒18h后，部分大黃魚親魚浮上水面，胸鰭、腹鰭、尾鰭、鰓蓋等部位均有出血癥狀，鱗片出現脫落（圖3）。

2.3.4.2大黃魚體內各組織病變特征分析

通過解剖發現，大黃魚幼魚頭腎、肝臟等組織結構清晰，保持較為完整狀態。但患病親魚的頭腎、肝臟等組織出現糜爛等癥狀（圖4）。

3結論與討論

菌種鑒定是一項繁瑣的工作。海洋細菌數量繁多、種類復雜，特別是同一屬菌株間性質相似度較高，更增加了鑒定工作的難度。因此，通常須要同時采用多種儀器、生化指標、試驗手段，經綜合測定分析后才能較準確鑒定細菌種類[8]。本

研究首先采用選擇性培養基TCBS進行病原菌培養。TCBS培養基上形成的菌落基本為黃色，其中含有少量綠色菌株。在TCBS培養基上，菌落呈圓形，隆起，邊緣整齊，表現出海洋弧菌在TCBS培養基上生長的典型癥狀。培養過程中，發現

菌株070925較為黏稠，與副溶血弧菌的特性相符[9]。哈維氏

弧菌在過夜培養時，培養溫度低于30℃時可以正常生長，而副溶血弧菌的培養溫度必須維持在30℃才能過夜培養，該結果與副溶血弧菌對低溫較為敏感的報道[10-12]一致。在生理生化水平方面，采用自動微生物檢測系統（AMS）和鑒定卡GNI進行菌種鑒定，結果表明2種病原菌均為海洋弧菌。另外，參照文獻中葡萄糖氧化、生長控制、蔗糖發酵等生化特征[13]，初步判斷這2種菌為海洋弧菌。最后根據16SrDNA序列確定為哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。

哈維氏弧菌和副溶血弧菌是條件性致病菌[14]。隨著養殖水域生態環境的惡化，海洋弧菌已成為引起魚類病害的主要致病菌之一。本研究通過人工感染發現，哈維氏弧菌和副溶血弧菌的混合菌液對大黃魚具有較強的毒力，針對不同體質的大黃魚，其致病性有所不同。大黃魚親魚更容易感染細菌，同時顯示出較明顯的病癥，而對于幼魚而言，其致病性相對較弱。

本研究對2種海洋弧菌進行了鑒定，同時對2種不同生理狀態的大黃魚感染2種海洋弧菌的發病機制進行了初探，這為大黃魚人工繁育、親魚抗病力的研究提供了理論基礎，也為大黃魚免疫機制的深入研究奠定了基礎。

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