藥用植物湖北羅田蒼術亞種的花粉母細胞減數分裂過程

段院生+朱斌+舒少華+王沫

摘要：藥用植物湖北羅田蒼術因其特有的形態和地理分布被劃分為一個新亞種。對羅田蒼術的花粉母細胞減數分裂過程進行了觀察，結果表明，染色體（2n=24）正常配對與分離，沒有出現未配對染色體，在2次分裂后期和末期沒有落后染色體及形成微核，最后產生較高比例的可育花粉。研究結果為羅田蒼術的較高結實率及種子的高成活率提供了細胞學解釋。

關鍵詞：蒼術；減數分裂；花粉母細胞；繁殖方式；花粉育性

中圖分類號：S567.23+9.03文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0273-02

藥用植物蒼術（Atractylodeslancea）為菊科蒼術屬多年生草本植物，分布并栽培于我國的許多地區，收獲其根狀莖干燥后作藥用。根莖含揮發油，主要成分為茅術醇、桉葉油醇、蒼術酮等；可制成祛濕藥、健脾藥、解表藥，主治濕困脾胃、胞痞腹脹、食欲不振、嘔吐泄瀉、濕腫、夜盲等癥。湖北省羅田和英山一帶的蒼術植株、葉、頭狀花序及花的各部均較大，與其他地區的蒼術有明顯的形態和地理分布差異，羅田蒼術含豐富的揮發油，含量比其他產地的高，因此被分為一個新亞種（Atractylodeslanceassp.luotianensis）[1]。羅田蒼術的特征是根狀莖香味濃郁、橫斷面有橙黃色或棕紅色油點，俗稱“珠砂點”，于2011年獲中國地理標志產品保護。近期細胞學研究表明，該地區蒼術的染色體數為2n=24，與其他地區的相同，但只有1對染色體的短臂上出現隨體[2]，相關報道表明，相同染色體數的蒼術均有2對染色體帶有隨體[3-4]。另用熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）技術，在羅田蒼術的染色體上檢測到1對染色體帶有5SrDNA位點，另外2對染色體帶有45SrDNA位點，其中1對為隨體染色體[2]。故1對染色體上的45SrDNA位點沒有表達，沒有隨體的形成。因此，羅田地區的蒼術可能在占據該地區后發生了染色體水平上的分化，為其亞種的分類地位提供了細胞學證據。

由于蒼術產生兩性花或單性花，兩者多異株，單性花一般為雌花；兩性花植株具有一定結實率而產生種子。蒼術的繁殖方法有種子繁殖、分株繁殖、根莖繁殖，但僅兩性花產生種子，且種子成熟后易霉爛，致使種子繁殖較困難。鑒于羅田蒼術較其他蒼術有不同的形態及細胞學特征，本研究觀察了花粉母細胞減數分裂過程，為羅田蒼術繁殖方式提供細胞學證據。

1材料與方法

1.1材料制備

蒼術花序采自湖北省英山縣陶家河鄉。在7月蒼術的初花期，上午在地里辨認兩性花植株，將花序取下直接投入準備好的固定液中（95%乙醇∶冰醋酸=3∶1），帶回武漢換入新鮮固定液，放置過夜，次日將固定的材料轉入70%乙醇溶液中置于4℃的冰箱中備用。

1.2細胞學觀察

觀察花粉母細胞減數分裂時，將固定的花序用自來水洗去乙醇后，用解剖針挑出不同時期的花藥，放于盛1mol/L鹽酸溶液的小杯中，于60℃水浴鍋中酸解3min；將花藥置于清潔載玻片中央的1小滴水中，用解剖針搗碎并挑除大塊花藥壁雜質，加1滴卡寶品紅染色液染色，取干凈的蓋玻片蓋上，用濾紙包住蓋片，用手指輕輕擠壓蓋片除去多余的染色液，并使細胞散開。然后在顯微鏡下觀察細胞學制片，辨認細胞分裂的時期，將合適及清晰的細胞圖像儲存于計算機中供分析。

1.3花粉育性觀察

觀察花粉育性時，在晴天采當天開放的花朵，用鑷子取出花藥置于載玻片上，加1滴醋酸洋紅染色液，用鑷子擠壓出花粉粒并去除藥壁組織后，蓋上蓋玻片，用濾紙包住蓋片并用手指輕輕擠壓蓋片除去多余的染色液，在光學顯微鏡下觀察?？捎幕ǚ鄞蠖鴪A并能著色，不育花粉小而癟并不能著色。每個單株觀察200～300個花粉粒。

2結果與分析

2.1取材時間及方式

因蒼術的兩性花與單性雌花多異株，要在開花后才能在群體中分辨出兩性花植株，取其花序固定觀察花粉母細胞減數分裂。蒼術為頭狀花序，單個花蕾很小，特別是處于花粉母細胞減數分裂期的花蕾更小。固定的未開放的不同大小的花序中，處于花粉母細胞減數分裂期的花序比例較小，有時即使很小的花序里面的花藥都已產生花粉。要從大量固定的花序中才能挑選到合適的花藥，觀察到減數分裂的全過程。表明蒼術花粉母細胞減數分裂在花序與花發育的較早時期進行，始花時1株蒼術上大多數花序的分裂高峰已過。較理想的取材方式為在第1年鑒定出兩性花植株，第2年將其無性繁殖，在未開花前取幼小的花序固定。

2.2花粉母細胞減數分裂過程

在第1次減數分裂的前期I，細線期花粉母細胞（pollenmothercells，PMCs）的細胞輪廓清晰可見，呈圓形或卵園形，細胞質染色均勻，染色體呈一團細線纏繞在一起，只在線團的邊緣可見向外伸展的單條染色體，僅占據細胞的較小體積（圖1-a）；但在少部分細胞中，除大的染色體團外，還觀察到1至數個染色較深、體積小很多的染色團，從染色特性及形態判斷不是外來的雜質，而可能是染色質，這些額外染色質的來源可能是PMCs間的細胞融合（cytomixis）時發生的染色質穿壁，使其他細胞的部分染色體轉移過來。這種現象在某些植物的減數分裂過程中已有報道，可引起群體中染色體數目的變異[5-6]。該結果為蒼術種間與種內的染色體數目變異提供了解釋，在蒼術中常觀察到非整倍體的細胞[2-3]。在偶線期，染色體變粗，分布在整個細胞內（圖1-b）；但未能觀察到染色體形態理想的粗線期PMCs。在雙線期及終變期PMCs內，染色體變得粗短，可見多數染色體并排成對出現，沒有明顯的交叉結；只在較大的染色體對（二價體）間可見明顯的交叉結，可區分每個二價體，計數有12個二價體（圖1-c）；在中期I時，二價體排列在細胞中央，二價體中每條染色體定向細胞兩極，可見較小二價體的2條染色體已分開但仍有染色質絲相聯，而較大二價體的2條染色體還由末端交叉結連接（圖1-d）；在后期與末期I時，染色體達到兩極后形成2個子細胞（圖1-e），但沒有細胞質分裂而進入第2次減數分裂。在顯微鏡下較難區分后期/末期I與前期IIPMCs。在中期II，在同一個細胞內染色體分兩組呈一字形排列（圖1-f）；在后期/末期II，染色體分裂后產生4個子核/子細胞，細胞外的胼胝質壁出現（圖1-g）；最后由4個子細胞發育成花粉粒（圖1-h）。花粉的可染率（可育率）為93.7%。故蒼術表現的是同時型小孢子發生，即在減數分裂的2次分裂中細胞質只分裂1次，且具有3孔花粉（圖1-g）。染色體間的長短差異顯著，與染色體核型分析結果一致，最長染色體與最短染色體的長度比超過2∶1[2]（圖1-i）。endprint

3討論

在觀察的材料中，蒼術花粉母細胞減數分裂過程中沒有出現染色體落后及微核，顯示正常的染色體配對與分離，最后產生較高可育的花粉。為蒼術的較高結實率提供了細胞學解釋。正常的減數分裂也保證了蒼術染色體數目的穩定，因蒼術屬所有種（包括白術，AatractylodesmacrocehpalaKoidz）和亞種的染色體數都為2n=24[2-4]。少數細胞中出現的其他染色體數的原因有待進一步研究。

蒼術在自然條件下通過根莖無性繁殖，但同時仍進行較正常的種子繁殖。這與天南星科的半夏（Pinelliaternata）有明顯差別，因其以珠芽和塊莖繁殖的無性繁殖為主，因種子結實率低及種子發芽差而有性繁殖退化。細胞學觀察表明，染色體數變化較大的多倍體系列群體，減數分裂過程常出現不配對染色體、落后染色體及微核，導致花粉育性很低[5]。三百草科的魚腥草（Houttuyniacordata）也是多倍體系列，主要以地下莖繁殖；花粉母細胞減數分裂中發生高頻率的細胞融合及異常，花粉育性極低；但可能由孤雌生殖產生較多種子，且種子萌發好[6]。蒼術為二倍體物種（2n=2x=24），不能忍耐染色體數的變化，至少羅田一帶蒼術的有性生殖還未退化，而其他蒼術的減數分裂過程還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]胡世林，馮學鋒，王玠，等.中國蒼術屬一新亞種[J].植物分類學報，2001，39（1）：84-86.

[2]王臣，邢秀芳，王宗霞，等.東北產蒼術屬植物的細胞學研究[J].植物研究，1997，17（1）：79-84，128.

[3]李俊英，李茂輝.東北蒼術屬三種主要核型的研究[J].沈陽農業大學學報，1988，19（4）：58-61.

[4]葛傳吉，李巖坤，周月，等.白術染色體核型分析[J].云南植物研究，1987，9（1）：116-118.

[5]LiuY，HuiRK，DengRN，etal.AbnormalmalemeiosisexplainspollensterilityinthepolyploidmedicinalplantPinelliaternata（Araceae）[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：112-120.

[6]GuanJZ，WangJJ，ChengZH，etal.CytomixisandmeioticabnormalitiesduringmicrosporogenesisareresponsibleformalesterilityandchromosomevariationsinHouttuyniacordata[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：121-130.endprint

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在觀察的材料中，蒼術花粉母細胞減數分裂過程中沒有出現染色體落后及微核，顯示正常的染色體配對與分離，最后產生較高可育的花粉。為蒼術的較高結實率提供了細胞學解釋。正常的減數分裂也保證了蒼術染色體數目的穩定，因蒼術屬所有種（包括白術，AatractylodesmacrocehpalaKoidz）和亞種的染色體數都為2n=24[2-4]。少數細胞中出現的其他染色體數的原因有待進一步研究。

蒼術在自然條件下通過根莖無性繁殖，但同時仍進行較正常的種子繁殖。這與天南星科的半夏（Pinelliaternata）有明顯差別，因其以珠芽和塊莖繁殖的無性繁殖為主，因種子結實率低及種子發芽差而有性繁殖退化。細胞學觀察表明，染色體數變化較大的多倍體系列群體，減數分裂過程常出現不配對染色體、落后染色體及微核，導致花粉育性很低[5]。三百草科的魚腥草（Houttuyniacordata）也是多倍體系列，主要以地下莖繁殖；花粉母細胞減數分裂中發生高頻率的細胞融合及異常，花粉育性極低；但可能由孤雌生殖產生較多種子，且種子萌發好[6]。蒼術為二倍體物種（2n=2x=24），不能忍耐染色體數的變化，至少羅田一帶蒼術的有性生殖還未退化，而其他蒼術的減數分裂過程還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]胡世林，馮學鋒，王玠，等.中國蒼術屬一新亞種[J].植物分類學報，2001，39（1）：84-86.

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[6]GuanJZ，WangJJ，ChengZH，etal.CytomixisandmeioticabnormalitiesduringmicrosporogenesisareresponsibleformalesterilityandchromosomevariationsinHouttuyniacordata[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：121-130.endprint

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在觀察的材料中，蒼術花粉母細胞減數分裂過程中沒有出現染色體落后及微核，顯示正常的染色體配對與分離，最后產生較高可育的花粉。為蒼術的較高結實率提供了細胞學解釋。正常的減數分裂也保證了蒼術染色體數目的穩定，因蒼術屬所有種（包括白術，AatractylodesmacrocehpalaKoidz）和亞種的染色體數都為2n=24[2-4]。少數細胞中出現的其他染色體數的原因有待進一步研究。

蒼術在自然條件下通過根莖無性繁殖，但同時仍進行較正常的種子繁殖。這與天南星科的半夏（Pinelliaternata）有明顯差別，因其以珠芽和塊莖繁殖的無性繁殖為主，因種子結實率低及種子發芽差而有性繁殖退化。細胞學觀察表明，染色體數變化較大的多倍體系列群體，減數分裂過程常出現不配對染色體、落后染色體及微核，導致花粉育性很低[5]。三百草科的魚腥草（Houttuyniacordata）也是多倍體系列，主要以地下莖繁殖；花粉母細胞減數分裂中發生高頻率的細胞融合及異常，花粉育性極低；但可能由孤雌生殖產生較多種子，且種子萌發好[6]。蒼術為二倍體物種（2n=2x=24），不能忍耐染色體數的變化，至少羅田一帶蒼術的有性生殖還未退化，而其他蒼術的減數分裂過程還有待進一步研究。

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[6]GuanJZ，WangJJ，ChengZH，etal.CytomixisandmeioticabnormalitiesduringmicrosporogenesisareresponsibleformalesterilityandchromosomevariationsinHouttuyniacordata[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：121-130.endprint