牛糞纖維素降解菌的篩選與初步鑒定

牛明芬+武肖媛+于海嬌+梁文娟+王思博

摘要：通過“富集—初篩—復篩”流程，篩選出4株對纖維素有強降解能力的菌株，分別標記為TG1、HN1、HP2、P3。對4株菌的纖維素酶活性進行了定量測定；通過生理生化試驗，初步鑒定TG1為放線菌，HP2為地衣芽孢桿菌，P3、HN1為枯草芽孢桿菌。

關鍵詞：纖維素降解菌；分離；纖維素酶活；鑒定

中圖分類號：Q939.9文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0393-02

隨著我國養牛行業的發展，牛存欄量也逐年增加。根據調查顯示，2009年我國奶牛存欄量達1260萬頭，2010年的存欄量達1420.1萬頭。存欄量為200～2000頭的肉奶牛基地，每天可產生的牛糞在5～50t[1]。未經處理的牛糞隨意堆放，不僅造成了人們的視覺污染，而且對大氣、土壤、水造成了很大污染。相較于其他畜禽糞便，牛糞含纖維素、半纖維素等有機難降解物質比較多，自然降解時間長[1-2]。

針對牛糞中含纖維素較多且自然降解時間長的特點，本試驗將降解纖維素能力強的菌株分離篩選出來，以期用于后續的牛糞堆肥試驗縮短牛糞堆肥發酵時間。

1材料與方法

1.1樣品采集

土壤樣品采自沈陽建筑大學樹林落葉堆積處；牛糞樣品采自本溪木蘭花牛場的鮮牛糞、腐熟牛糞、堆積1年的牛糞。落葉堆積處取樣時，在土層5～10cm處進行采樣，平面采樣用“之”字形取樣，剖面取樣采用定點取土[3]。

1.2培養基

培養基為：牛肉膏蛋白胨培養基、PDA培養基、高氏合成一號、剛果紅纖維素鈉篩選培養基、濾紙條液體培養基、羧甲基纖維素鈉培養基、牛肉膏蛋白胨酪素培養基、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）液體發酵培養基[3]、豆餅粉液體發酵培養基。

1.3試驗方法

1.3.1纖維素降解菌的富集分別稱取5g不同的采集樣品，置于45mL裝有玻璃珠無菌水的三角瓶中，放入30℃、120r/min的搖床，培養1d。

1.3.2纖維素降解菌的篩選（1）初篩：用稀釋涂布平板法，將10-7～10-4濃度的菌液涂于剛果紅纖維素鈉篩選培養基上，將平板分別放入30、50℃恒溫箱培養4d，挑取明顯的單菌落在PDA培養基上進行劃線純化，將純化好的菌種接入PDA培養基斜面保存。（2）復篩：將純化好的菌株點接到羧甲基纖維素鈉培養基上，放入30、50℃培養4d，用剛果紅染液進行染色，量取菌圈直徑（d）和透明圈直徑（D），并計算透明圈直徑與菌圈直徑比值D/d，選取D/d值與D值大的菌接入濾紙條液體培養基中，進行濾紙條崩潰試驗，觀察濾紙條崩潰的快慢和程度。選取使濾紙條崩潰程度大的菌，分別接種于CMC-Na液體發酵培養基、豆餅粉液體發酵培養基上，培養64h，測定纖維素酶活性。

1.3.3粗酶液的制備取發酵液倒入離心管中，3000r/min下離心10min，上清液即為粗酶液。

1.3.4纖維素酶活性測定[4-5]（1）羧甲基纖維素酶（CMCase）活性測定：根據GB20287—2006《農用微生物菌劑》進行羧甲基纖維素酶活測定；（2）濾紙酶（FPA）活性測定：根據NY/T1847—2010《微生物肥料生產菌株質量評價通用技術要求》進行濾紙酶活性測定。

1.3.5纖維素降解菌的初步鑒定[6-7]對篩選出的菌株菌落形態及顯微鏡下的形態進行觀察，并進行生理生化試驗。通過對照伯杰氏手冊完成對菌株的初步鑒定。

2結果與分析

2.1菌種初篩

通過剛果紅纖維素鈉篩選培養基的篩選，共獲得21株菌，其中從土壤中分離出來的菌有9株，都為常溫菌；從牛糞中共分離出來12株菌，其中常溫菌6株，高溫菌6株。將分離出來的菌在PDA培養基劃線純化后接種到PDA斜面保存，待用。

2.2菌種復篩

用剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗進行菌種復篩，測試菌株的纖維素降解能力，詳見表1。王志超等認為D/d值超過2.5的菌株纖維素酶活性高[8]。也有人認為，D>2cm時，酶活較高。從表1可以看出，菌株P1、HN1的D/d值超過了2.5，且透明圈直徑D大于2cm；菌株P3、HP2、TG1、TG4的D/d值接近2.5，且透明圈直徑D大于或接近2cm，纖維素酶活性也相對比較高。

選用P1、HN1、TG1、HP2、P3做濾紙條崩潰試驗，試驗結果見表2。由表2可以看出，接種TG1濾紙條崩潰得最快最明顯，P1最不明顯。

綜合剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗，篩選出HN1、TG1、HP2、P34株菌進行后續纖維素酶活性的定量測定與菌株的初步鑒定。

2.3纖維素酶活性的測定結果

將篩選得到的4株菌分別接入CMC-Na液體發酵培養基、豆餅粉液體發酵培養基中，培養64h，對其進行CMCase酶活性和FPA酶活性的測定，結果見表3。

由表3可以看出，TG1在CMC-Na液體發酵培養基中產生的酶活性要高于其在豆餅粉液體發酵培養基中的；HN1、HP2、P3這3株菌在豆餅粉液體發酵培養基中的酶活性要高些，可以在后續的發酵優化試驗中作為參考菌株。

2.4纖維素降解菌的初步鑒定結果

2.4.1TG1鑒定結果（1）菌落特征：在高氏合成一號培養基上長的比較快，菌落為圓形，中間凸起，初期為白色，之后菌落出現灰色粉末物質，易被挑取，有強烈的土腥味。（2）顯微觀察結果：革蘭氏染色為陽性，可看到孢子絲呈直形。根據以上試驗結果初步鑒定TG1為放線菌。

2.4.2P3鑒定結果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上干燥，呈半透明、邊緣不規則狀，培養基背面微發黃，有一定黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結果：菌株P3呈短桿狀，有芽孢生成。（3）生理生化試驗結果：菌株P3為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為25～30℃，可使明膠液化，V-P反應與甲基紅試驗呈陽性，可降解淀粉，產過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，在初始pH值為9的培養基中生長良好。根據以上試驗結果初步鑒定P3為枯草芽孢桿菌。endprint

2.4.3HN1鑒定結果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上呈乳白色，圓形，不透明，邊緣為波浪狀，有褶皺，有黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結果：菌株HN1呈短桿狀，芽孢中生。（3）生理生化試驗結果：菌株HN1為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應呈陽性，甲基紅試驗呈陰性，可降解淀粉，產過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，不能在厭氧環境中生長，在初始pH值為8～9的培養基中生長良好。根據以上試驗結果，初步鑒定HN1為枯草芽孢桿菌。

2.4.4HP2鑒定結果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上長勢良好，菌落呈大片狀，向外擴張，不透明，背面呈現紅色，易挑取。（2）顯微觀察結果：菌株HP2呈短桿狀，芽孢端生。（3）生理生化試驗結果：菌株HP2可在有氧環境中生長，也可在厭氧條件下生長，在厭氧環境中生長產生紅色色素，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應與甲基紅試驗呈陽性，產過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，在初始pH值為8～9的培養基中生長良好。根據以上試驗結果，初步鑒定HP2為地衣芽孢桿菌。

3結論與討論

本試驗從腐熟的牛糞與土壤中共分離出21株對纖維素有分解能力的菌株，土壤中分離出的9株菌均為常溫菌，牛糞中分離出6株高溫菌和6株常溫菌。通過剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗進行復篩，篩選出4株對纖維素降解能力強的菌株。

用2種基礎發酵培養基對篩選出的4株菌進行纖維素酶活性的定量測定，發現菌株P3、HN1、HP2在豆餅粉發酵培養基中的酶活性較高，TG1在CMC-Na發酵培養基中的酶活性較高，在下一步進行發酵培養基優化中可做參考。FPA酶活與CMCase活性高低不一致，說明降解纖維素的酶是一種纖維素復合酶。經初步鑒定，HP2為地衣芽孢桿菌；P3、HN1為枯草芽孢桿菌；TG1為放線菌。在牛糞降解菌中的細菌多為芽孢桿菌[9]，這與本試驗結果一致。

參考文獻：

[1]任平，趙文娟，張強，等.不同微生物酶對牛糞堆肥腐熟的影響[J].安徽農業科學，2010，38（5）：2525-2526，2592.

[2]方華舟，王培清.牛糞堆肥各階段主要纖維素降解菌分離與作用規律分析[J].中國土壤與肥料，2012（6）：88-92.

[3]孫一博.高效纖維素降解菌的篩選鑒定及特性研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2013：1-53.

[4]GB20287—2006農用微生物菌劑[S].

[5]NY/T1847—2010微生物肥料生產菌株質量評價通用技術要求[S].

[6]中國科學院微生物研究所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M].北京：科學出版社，1978.

[7]布坎南RE，吉布斯NE.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京：科學出版社，1984

[8]王志超，陸文靜，王洪濤.好氧堆肥中高溫纖維素分解菌的篩選及性狀研究[J].北京大學學報：自然科學版，2006，42（2）：259-264.

[9]劉佳，李婉，許修宏，等.接種纖維素降解菌對牛糞堆肥微生物群落的影響[J].環境科學，2011，32（10）：3073-3081.endprint

2.4.3HN1鑒定結果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上呈乳白色，圓形，不透明，邊緣為波浪狀，有褶皺，有黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結果：菌株HN1呈短桿狀，芽孢中生。（3）生理生化試驗結果：菌株HN1為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應呈陽性，甲基紅試驗呈陰性，可降解淀粉，產過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，不能在厭氧環境中生長，在初始pH值為8～9的培養基中生長良好。根據以上試驗結果，初步鑒定HN1為枯草芽孢桿菌。

2.4.4HP2鑒定結果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上長勢良好，菌落呈大片狀，向外擴張，不透明，背面呈現紅色，易挑取。（2）顯微觀察結果：菌株HP2呈短桿狀，芽孢端生。（3）生理生化試驗結果：菌株HP2可在有氧環境中生長，也可在厭氧條件下生長，在厭氧環境中生長產生紅色色素，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應與甲基紅試驗呈陽性，產過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，在初始pH值為8～9的培養基中生長良好。根據以上試驗結果，初步鑒定HP2為地衣芽孢桿菌。

3結論與討論

本試驗從腐熟的牛糞與土壤中共分離出21株對纖維素有分解能力的菌株，土壤中分離出的9株菌均為常溫菌，牛糞中分離出6株高溫菌和6株常溫菌。通過剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗進行復篩，篩選出4株對纖維素降解能力強的菌株。

用2種基礎發酵培養基對篩選出的4株菌進行纖維素酶活性的定量測定，發現菌株P3、HN1、HP2在豆餅粉發酵培養基中的酶活性較高，TG1在CMC-Na發酵培養基中的酶活性較高，在下一步進行發酵培養基優化中可做參考。FPA酶活與CMCase活性高低不一致，說明降解纖維素的酶是一種纖維素復合酶。經初步鑒定，HP2為地衣芽孢桿菌；P3、HN1為枯草芽孢桿菌；TG1為放線菌。在牛糞降解菌中的細菌多為芽孢桿菌[9]，這與本試驗結果一致。

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2.4.3HN1鑒定結果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上呈乳白色，圓形，不透明，邊緣為波浪狀，有褶皺，有黏度，不易挑取。（2）顯微觀察結果：菌株HN1呈短桿狀，芽孢中生。（3）生理生化試驗結果：菌株HN1為好氧菌，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應呈陽性，甲基紅試驗呈陰性，可降解淀粉，產過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽，不可利用丙酸鹽，不能在厭氧環境中生長，在初始pH值為8～9的培養基中生長良好。根據以上試驗結果，初步鑒定HN1為枯草芽孢桿菌。

2.4.4HP2鑒定結果（1）菌落特征：菌落在牛肉膏蛋白胨培養基上長勢良好，菌落呈大片狀，向外擴張，不透明，背面呈現紅色，易挑取。（2）顯微觀察結果：菌株HP2呈短桿狀，芽孢端生。（3）生理生化試驗結果：菌株HP2可在有氧環境中生長，也可在厭氧條件下生長，在厭氧環境中生長產生紅色色素，革蘭氏染色為陽性，生長最適溫度為45～50℃，可使明膠液化，V-P反應與甲基紅試驗呈陽性，產過氧化氫酶，能還原硝酸鹽，可在0～7%鹽濃度中生長，能利用檸檬酸鹽與丙酸鹽，在初始pH值為8～9的培養基中生長良好。根據以上試驗結果，初步鑒定HP2為地衣芽孢桿菌。

3結論與討論

本試驗從腐熟的牛糞與土壤中共分離出21株對纖維素有分解能力的菌株，土壤中分離出的9株菌均為常溫菌，牛糞中分離出6株高溫菌和6株常溫菌。通過剛果紅染色羧甲基纖維素鈉與濾紙條崩潰試驗進行復篩，篩選出4株對纖維素降解能力強的菌株。

用2種基礎發酵培養基對篩選出的4株菌進行纖維素酶活性的定量測定，發現菌株P3、HN1、HP2在豆餅粉發酵培養基中的酶活性較高，TG1在CMC-Na發酵培養基中的酶活性較高，在下一步進行發酵培養基優化中可做參考。FPA酶活與CMCase活性高低不一致，說明降解纖維素的酶是一種纖維素復合酶。經初步鑒定，HP2為地衣芽孢桿菌；P3、HN1為枯草芽孢桿菌；TG1為放線菌。在牛糞降解菌中的細菌多為芽孢桿菌[9]，這與本試驗結果一致。

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[9]劉佳，李婉，許修宏，等.接種纖維素降解菌對牛糞堆肥微生物群落的影響[J].環境科學，2011，32（10）：3073-3081.endprint